2.1.2.5. Ионные каналы

Логическим продолжением изучения ионных механизмов воз­буждения нервных и мышечных клеток явилась разработка мето­дики для регистрации токов через одиночные каналы. В 1980 г. немецкие ученые Ф. Сигворс и Э. Неер с помощью метода ло­кальной фиксации смогли зарегистрировать ток через одиноч­ный натриевый канал, открытый (активированный) с помощью деполяризации мембраны. Для этого они использовали стеклян­ную микропипетку (внешний диаметр кончика 2 мкм, внутренний около 0,5 мкм), в которую втягивали с помощью небольшого ва­куума участок мембраны нервной клетки (рис. 2.11, А, Б). Кле­точная мембрана плотно контактировала с кончиком пипетки, что препятствовало утечке тока. На ограниченном микропипет­кой пространстве клеточной мембраны могли оказаться 1...2 от­дельных канала. Ток, протекающий через открытый канал, пода­вался на вход усилителя, с помощью которого напряжение на дан­ном участке мембраны фиксировалось по тому же принципу, как и в методике фиксации напряжения на всем участке мембраны нервного волокна или клетки. Оказалось,что токи через одиноч-

30

г

60 мс

Рис. 2.11. Ионные токи одиночных ионных каналов:

А - схематическое изображение экспериментальной установки: 1- нервная клетка; 2- мик­ропипетка; 3 - усилитель; стрелкой показано подведение небольшого вакуума для приса­сывания кончика микропипетки к участку мембраны нервной клетки; Б - в увеличенном масштабе показано прикрепление с помощью небольшого вакуума кончика микропипетки к участку мембраны нервной клетки: 2- кончик микропипетки; 4-высокоомный контакт между стенками пипетки и мембраной; 5- ионные каналы; 6- клеточная мембрана; стрел­кой показано направление тока через открытый канал; В - электрические ответы одиноч­ных каналов (а): вверху - ступенчатообразный деполяризационный сдвиг мембранного по­тенциала; Г. вверху-суммарный ионный ток из 144 ответов одиночных ионных каналов; внизу — калибровка времени 60 мс

ные каналы подчиняются закону «все или ничего», имеют ступен-чатообразную форму с быстрым фронтом нарастания и спада, так­же одинаковы по амплитуде для разных каналов (рис. 2.11, В). Ин­тересно отметить, что длительность пребывания каналов в откры-

54

55

том состоянии варьирует случайным образом и в довольно ши­роких пределах. Среднее время нахождения канала в открытом состоянии составляет менее 1 мс и зависит от величины мем­бранного потенциала. Вместе с тем проводимость каналов практически не зависит от напряжения на мембране и имеет чрезвычайно низкое значение (н10 пкСм, т. е. 10 • 10 ¹² См). По­скольку проводимость — величина, обратная сопротивлению, то соответственно сопротивление одного ионного канала будет иметь огромную величину— 10^й Ом. Расчеты показывают, что в начале развития потенциала действия открытые натриевые каналы пропускают примерно 6000 ионов натрия за 1 мс. Об­щий натриевый ток, который отвечает за восходящую фазу потенциала действия, равен сумме тысяч очень слабых им­пульсных токов, обусловленных открытием отдельных натрие­вых каналов. На рис. 2.11, В продемонстрированы ответы оди­ночного натриевого канала при деполяризации мембраны мы­шечной клетки. Срабатывание каналов проявляется в виде «всплесков» тока различной длительности и разным временем открывания от начала деполяризации.

На рисунке 2.11, Г представлен суммарный ток, полученный в результате сложения 144 ответов одного и того же участка мембра­ны. Динамика этого тока отражает распределение во времени от­крывания одиночных каналов на деполяризацию. Хорошо видно, что она сходна с временным ходом общего, макроскопического натриевого тока через мембрану в режиме фиксации напряжения при деполяризации мембраны (см. рис.2.10).

Таким образом, функционирование ионных каналов, обеспе­чивающих генерацию потенциалов действия, зависит от величины напряжения на мембране; данный тип каналов получил название потенциалзависимых или потенциалуправляемых. Потенциалза-висимый канал представляет собой гликопротеид, находящийся в липидном бислое мембраны (рис. 2.12). Канал структурно связан с другими мембранными белками и элементами цитоскелета клет­ки. Макромолекула натриевого канала включает 1800...4000 ами­нокислот, организованных в одну или несколько полипептидных цепей с сотнями ковалентно связанных полисахаридных остатков на наружной поверхности. Гидрофильные аминокислоты высти­лают стенки поры, а гидрофобные контактируют с липидами би-слоя. В канале выделяют внутреннее и наружное устья, пору, ко­торая с помощью специального механизма может открываться и закрываться, и селективный фильтр, являющийся самой узкой ча­стью поры для прохода ионов. Механизм, ответственный за от­крывание канала, получил название воротного и представляет собой некую заряженную структуру. Вероятно, в покое потен-циалзависимый канал (например, натриевый канал) механически закрыт этой заряженной структурой. При деполяризации мембра­ны размеры или расположение этой структуры изменяются так, что

56

Рис. 2.12. Схематическое изображе- /

ние потенциалактивируемого ионно­го канала:

А — наружная среда; Б — внутриклеточ­ная среда; 1 — липидный бислой; 2,3 — воротный механизм (2 — сенсор на­пряжения, 3 — «ворота»); 4 — белковая макромолекула; 5 — якорный белок; б—углеводная цепочка; 7—селектив­ный фильтр; 8— пора для прохода ионов

канал открывается. В поль­зу того, что в канале проис­ходят подобного вида пере­стройки, указывает регист- g рация так называемых «во­ротных токов», возникаю­щих при движении участ­ков молекул, имеющих за­ряженные группы. Измене­ния потенциала на мебране на сотые доли вольта могут существенно повлиять на расположение участков молекул, имею­щих заряженные группы. В частности, деполяризация на 40...50 мВ обычно приводит к открыванию большей части каналов в мембра­не. Толщина бислоя мембраны, в котором находятся каналы, со­ставляет около 10 нм (Ю^-8 см). Значит, при деполяризации на 50 мВ через этот бислой возникает изменение напряжения, рав­ное 5 • 10~² В на Ю^-6 см, или 50000 В/см. Несомненно, что заря­женные группы белков — каналов будут реагировать на такие из­менения напряжения и отвечать на них пространственными пере­стройками каких-то участков белковых молекул.

Существенный вклад в изучение природы токов через возбуди­мые мембраны внесли фармакологические исследования. Были найдены химические вещества (химические инструменты), кото­рые избирательно (селективно) могли блокировать натриевый и калиевый ток — натриевые и калиевые каналы. Так, тетродоток-син — вещество, выделенное из внутренних органов рыбы игло­брюха (рыбы, обитающей у берегов Японии), способен входить в натриевые каналы и блокировать их. Опыты, проведенные на раз-ничных видах нервных клеток, показали, что тетродотоксин пол-i юстью подавляет потенциалзависимую натриевую проводимость, возникшую в норме при деполяризации; в то же время задержан­ный калиевый ток оставался неизменным. Кинетические особен­ности блокирования натриевых каналов свидетельствуют о том, что каждая молекула тетродотоксина связывается с одним кана-юм. Для калиевых каналов также был найден селективный бло-катор — им оказался тетраэтиламмоний. Действие ионов тетра-

57

этиламмония при генерации потенциалов действия проявля­лось в замедлении спада нисходящей части потенциала действия и увеличении его длительности. На функционирование натри­евых каналов тетраэтиламмоний не оказывал влияния. Следует отметить, что с тех пор как Ходжкин и Хаксли выдвинули свою ионную гипотезу возбуждения, согласно которой в аксоне каль­мара существуют каналы, избирательно пропускающие ионы натрия и калия, в многочисленных опытах на нервных клетках беспозвоночных и позвоночных животных были найдены дру­гие типы электровозбудимых каналов для натриевых и калиевых ионов, а также для ионов кальция и хлора. Кроме того, была об­наружена большая группа каналов, работа которых управляется различными химическими веществами.

Экспериментальные данные о прохождении ионных токов через электровозбудимую мембрану позволяют проследить пос­ледовательность возникновения потенциала действия. Первым этапом является деполяризация мембраны (снижение потенци­ала покоя) с помощью раздражителя. По мере того как мемб­ранный потенциал приближается к пороговому уровню, начи­нают открываться натриевые каналы и возникает входящий ток, переносимый ионами натрия. В том случае, если мембранный потенциал ниже порогового, выход ионов калия через калиевые каналы, которые в большом количестве открыты в состоянии покоя, компенсирует вход положительных зарядов, обусловлен­ных натриевым током, и потенциалы действия не возникают. Пороговое же значение мембранного потенциала заключается в том, что вход ионов натрия начинает преобладать над выходом ионов калия. Достигнув порогового значения, входящий ток вызывает еще большую деполяризацию мембраны. Эта депо­ляризация приобретает самоускоряющийся регенеративный ха­рактер: вход в клетку положительных зарядов приводит к сдви­гу внутриклеточного потенциала в положительную сторону, при этом открываются новые натриевые каналы, вход ионов натрия усиливается и внутренняя поверхность клеточной мембраны становится еще более положительной.

Эти процессы обусловливают фазу нарастания потенциала дей­ствия. По мере того как мембранный потенциал приближается к равновесному потенциалу для ионов натрия, ЭДС, действующая на ионы натрия и равная разности между значением мембранного потенциала и равновесным натриевым потенциалом, все более снижается. Вследствие этого скорость изменения потенциала дей­ствия начинает снижаться, и так до тех пор, пока амплитуда по­тенциала действия не достигнет максимального значения, равного равновесному потенциалу для ионов натрия. Максимальное зна­чение потенциала действия примерно на 120 мВ положительнее, чем потенциала покоя. Следовательно, в результате самоускоряю­щейся деполяризации мембраны первичная пороговая деполяри-

58

зация (составляющая около 20 мВ), названная пассивной деполя­ризацией, усиливается в 5...6 раз. При достижении максимального значения потенциала действия начинается закрывание (инактива­ция) натриевых каналов. Казалось бы, этого процесса было доста­точно для постепенного уменьшения потенциала действия и вос­становления исходного мембранного потенциала. Однако процесс ускоряется благодаря дополнительному открыванию потенциал-зависимых калиевых каналов. Увеличение числа открытых ка­лиевых каналов способствует выходу ионов калия из клетки и соответственно удалению положительных зарядов. Происходит более быстрое возвращение (реполяризация) мембранного потен­циала к исходному уровню. Повышенная проводимость для ионов калия сохраняется еще некоторое время (мс), поэтому мембран­ный потенциал становится в этот период более электроотри­цательным, чем в исходном состоянии (следовая гиперполяри­зация). После окончания потенциала действия Na⁺ — K⁺ насос восстанавливает исходную внутриклеточную концентрацию ионов калия и натрия.