Часть II. Санитарно-микробиологический

КОНТРОЛЬ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

НАучные основы проведения

санитарно-микробиологического контроля природных сред и объектов

производственной деятельности человека

Учитывая сложные цепи превращений, осуществляемых микроорганизмами в процессе малого биологического круговорота, следует помнить, что любое нарушение среды обитания этих существ может повлечь за собою разрушение отлаженных закономерностей, вследствие чего контроль за состоянием окружающей среды приобретает особое значение. Контроль за состоянием объектов окружающей среды должен сопровождаться наблюдением за жизнедеятельностью микрофлоры, особенно тех ее представителей, которые могут резко изменить экологическую или санитарную обстановку в отдельных природных средах и производственных объектах. Эти вопросы, игнорирование которых способно нанести человеческой популяции ущерб, находятся в компетенции санитарной микробиологии, ставящей и решающей задачи:

1) изучение закономерностей взаимообмена потенциально опасных для человека микроорганизмов между микропопуляциями людей, животных и совокупностью объектов окружающей среды, включая условия существования микроорганизмов в этих средах;

2) поиск и использование микробиологических методов оценки безопасности для человека пищевых продуктов, воды, воздуха и разнообразных предметов и материалов;

3) разработка нормативов, устанавливающих соответствие качественного и количественного состава микрофлоры конкретных объектов внешней среды гигиеническим требованиям;

4) выдвижение рекомендаций с целью оздоровления внешней среды посредством антимикробных мероприятий и оценки их эффективности.

Стандартная микробиологическая лаборатория.

Основные методы работы

Устройство лаборатории.

Оборудование и приборы, эксплуатация

Микробиологические лаборатории подразделяют на научно-исследо­вательские, научно-практические, практические учреждения либо подразделения медицинских, ветеринарных, сельскохозяйственных учреждений или промышленных предприятий, проводящих исследования микроорганизмов и вызываемых ими явлений.

Для микробиологической лаборатории обычно отводится специальное помещение, состоящее из комплекса комнат, разделяющегося на «чистую» и «заразную» зоны.

В «чистой» зоне располагаются: комната для верхней одежды, помещения для проведения подготовительных работ (препараторская, моечная, средоварочная), стерилизационная, комната с холодильной камерой или холодильниками для хранения питательных сред и диагностических препаратов, комната отдыха и приема пищи, комната для надевания рабочей одежды, комната для работы с документацией и литературой, кабинет заведующего, подсобные помещения.

В «заразной» зоне располагаются: комната для приема и регистрации материала, боксированные помещения или помещения, оснащенные боксами биологической безопасности, термостатная комната, автоклавная для обеззараживания и профильные комнаты, в которых осуществляются бактериологические, серологические, гельминтологические, зооэнтомологические и прочие работы.

Назначение некоторых комнат микробиологической лаборатории:

- препараторская комната является местом работы обслуживающего персонала и подготовки оснащения к проведению микробиологического анализа;

- средоварочная комната предназначена для приготовления питательных сред; в ней допускается размещать автоклав для их стерилизации;

- моечная комната обеспечена холодной и горячей водой и необходима для подготовки посуды к стерилизации;

- автоклавная комната служит для обеззараживания и стерилизации, в ней размещают стерилизующее оборудование: автоклавы и сушильные шкафы. Стерилизации подвергают питательные среды и инструменты, а обеззараживанию – отработанный инфицированный материал;

- бокс-комната используется для пересева культур микроорганизмов и требует стерильных условий. Качественная стерилизация бокса достигается применением бактерицидной лампы. Бокс оборудуется предбоксником, служащим шлюзом для перехода из стерильной зоны в общую;

- термостатная комната предназначена для культивирования микроорганизмов.

В микробиологических лабораториях размещают специализированное оборудование, которое позволяет осуществлять весь цикл работ по обеспечению запланированного микробиологического анализа, направленного на тестирование самых разнообразных материалов.

Важнейшей частью работы в микробиологической лаборатории является стерилизация (от лат. sterilitas – бесплодный) – полное уничтожение микроорганизмов в объектах с целью исключения микробного загрязнения питательных сред, культур клеток и др. при микробиологических исследованиях и в биотехнологических производствах, а также для предупреждения их заноса в организм и предотвращения микробной биодеградации различных материалов.

Процесс стерилизации включает этапы дезинфекции, очистки с помощью моющих средств, сборки, группировки и размещения материалов в контейнере и камере стерилизатора, собственно стерилизации, сушки, контроля и хранения. Этапы дезинфекции, очистки, размещения преследуют цель снижения числа микроорганизмов на объекте и облегчения доступа к ним стерилизанта; этап стерилизации – полного освобождения объекта от микроорганизмов; этап контроля – проверки эффективности стерилизации с помощью механических, химических и биологических методов; этапы сушки и хранения – предупреждения повторной микробной контаминации в период от стерилизации до использования.

В качестве стерилизантов используют насыщенный высокотемпературный водяной пар (стерилизация паром), сухой горячий воздух (стерилизация жаром), химические вещества (стерилизация химическая), газ (стерилизация газовая), реже используют ионизирующие излучения (лучевая стерилизация), фильтрование через мелкопористые фильтры (механическая стерилизация), многократное прогревание жидкостей на водяной бане при 100 ⁰С (дробная стерилизация) или 56 ⁰С (тиндализация).

Кипячение, однократное прогревание при 100 ⁰С, облучение УФЛ не относятся к методам стерилизации, так как не обеспечивают полного уничтожения микроорганизмов, особенно спор.

Стерилизация паром. Насыщенный водяной пар под давлением обладает бактерицидными свойствами, не повреждает большинство стерилизуемых материалов и не нуждается в освобождении от стерилизанта. Для данного вида стерилизации характерны надежность, доступность, безопасность для персонала, экономичность, высокая степень автоматизации. Стерилизующий эффект пара связан с прогреванием объекта в процессе конденсации пара в воду на поверхности и внутри предмета. Выпускают два типа паровых стерилизаторов:

- стерилизаторы перемещения тяжестью; в них поток пара проникает в верхнюю часть камеры и вытесняет из нее воздух через дренажную трубку. Давление и температура пара возрастают и достигают установленной величины. Постоянную температуру до окончания экспозиции поддерживает таймер. По окончании экспозиции пар выводится через дренаж из камеры, рубашка камеры остается горячей и ее сухой жар высушивает стерилизуемые объекты. Крышка открывается при снижении температуры камеры до 90 ⁰С;

- предвакуумный паровой стерилизатор; в нем вакуумная система в 2 цикла вытягивает большую часть воздуха из камеры и стерилизуемых объектов через дренаж, после чего камеру и ее рубашку наполняют паром под давлением. Давление и постоянная температура поддерживаются автоматически. После окончания срока стерилизации камера освобождается от пара, и объекты высушиваются с помощью вакуумной системы.

В зависимости от стерилизуемых объектов температура пара в паровых стерилизаторах – 110–138 ⁰С, давление пара – 0,4–2,5 атм., экспозиция – 15–60 мин. Паром стерилизуют почти все изделия из металла, стекла, термостойкой пластмассы, резины, питательные среды, в том числе жидкие, лекарственные препараты. Стерилизация паром – предпочтительный способ стерилизации.

Стерилизация жаром. Стерилизуют ограниченный круг объектов: изделия из стекла и других термостойких материалов, безводные гидрофобные порошки, вазелин, предметы, не пропускающие необходимый уровень влаги. Осуществляют в сухожаровых шкафах. Обязательным условием эффективности стерилизации жаром является правильное соотношение между температурой и экспозицией, которое выражается так: при 180 ⁰С – 1/2 ч, при 170 ⁰С – 1 ч, при 160 ⁰С – 2 ч, при 150 ⁰С – 2,5 ч, при 140 ⁰С – 3 ч, при 120 ⁰С – 6 ч.

Стерилизация химическая проводится с помощью химических веществ, обладающих биоцидным действием: 2 %-ного щелочного водного раствора глютаральдегида и 20 %-ного раствора формальдегида в 70 %-ном этаноле. Химическая стерилизация осуществляется путем полного погружения объекта в раствор на относительно долгое время (около 10 ч) при комнатной температуре. При повышении температуры раствора до 40–50 ⁰С эффективность стерилизации резко возрастает, при температуре ниже 20 ⁰С, а также в кислой среде стерилизующий эффект может утрачиваться.

По окончании срока стерилизации предметы извлекают из раствора и в асептических условиях несколько раз споласкивают стерильной водой во избежание химических ожогов при контакте такого предмета с кожей и слизистыми оболочками.

Стерилизация газовая. В настоящее время используют этиленоксид – бесцветный газ, легко проникающий сквозь упаковочные материалы, хорошо контактирующий со всей поверхностью плотных предметов и легко проникающий в жидкие вещества, а также устраняющийся обычным проветриванием. Уничтожает все формы микроорганизмов, включая споры. Из-за сильной токсичности и длительности процесса газовая стерилизация используется только для обработки предметов, которые повреждаются при паровой стерилизации.

Контроль стерилизации:

1. Механический контроль, состоящий в визуальном и инструментальном контроле за всеми параметрами стерилизации. Измерительная аппаратура должна периодически контролироваться в государственном метрологическом учреждении.

2. Химический контроль, проводимый с помощью индикаторов, изменяющих цвет или плавящихся при достижении определенного уровня температуры, влажности, концентрации стерилизанта. Наружные индикаторы в виде стерилизационной ленты (окрашенной или нет) наносят на упаковку простерилизованного предмета, они указывают на то, что предмет прошел стерилизацию; внутренние химические индикаторы свидетельствуют о том, были ли стерилизуемые объекты подвергнуты действию одного или нескольких видов стерилизации, но не о стерильности объекта. Показатели внутренних химических индикаторов снимаются после окончания стерилизации.

3. Биологический контроль непосредственно указывает, произошло уничтожение микроорганизмов в процессе стерилизации или нет, то есть стерилен или нестерилен объект. Для паровой стерилизации в качестве биологического индикатора используют споры В. stearothermophilus, для стерилизации этиленоксидом – В. subtilis.

Бокс микробиологической лаборатории – специальное изолированное помещение, предназначенные для выполнения работ, требующих особой стерильности или безопасного пребывания людей. Микробиологический бокс используется для работ с инфекционными (посевы, пересевы, разведения и др.) и стерильными (приготовление питательных сред, культур тканей, разлив иммунных сывороток и др.) материалами.

В боксе должны быть созданы такие условия, которые, с одной стороны, исключали бы возможность лабораторного заражения сотрудников, а с другой, – предупреждали бы контаминацию стерильных материалов микроорганизмами. Пол, стены и двери бокса должны быть гладкими, сделаны из материала, хорошо поддающегося мойке и дезинфекции. Оборудование бокса: стол, табуреты, стеклянный шкаф для стерильных материалов, штативы, осветительные и бактерицидные лампы. В современных боксах имеются система подачи стерильного воздуха или устройство для ламинарного потока воздуха, создающего высокую степень стерильности и безопасности.

Термостат – аппарат, постоянно поддерживающий заданную температуру и используемый для культивирования микроорганизмов, культур клеток, протекания иммунологических или биохимических реакций. Состоит из нагревателя, термостатирующей камеры, вертикально разделенной на секции перфорированными полками, двойных стенок, между которыми размещается воздух или дистиллированная вода. Наружная стенка сделана из теплоизоляционного материала или содержит его. Дверцы также двойные, плотно закрывающиеся. Температура регулируется терморегуляторами различного типа.

Микроскопия в микробиологической лаборатории используется для выявления микроорганизмов в различных субстратах; ориентировочной идентификации микроорганизмов в исследуемом образце; определения некоторых морфологических признаков; изучения окрашенных мазков из колоний чистых культур. Существуют несколько различных видов микроскопии: световая, темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная, электронная.

Световой микроскоп – сложный оптический прибор, предназначенный для наблюдения за живыми и неживыми объектами. Состоит из механической (предметного столика с держателем предметного стекла и двумя винтами, перемещающими столик в двух перпендикулярных направлениях; тубуса; тубусодержателя; макро- и микровинтов), осветительной (осветителя, зеркала с плоской и вогнутой поверхностями и конденсора, расположенного под предметным столиком и состоящего из 2 линз, ирисовой диафрагмы и оправы светофильтров) и оптической (набора объективов и окуляров) частей.

В световом микроскопе луч от источника света попадает на зеркало, отражаясь от него и проходя через конденсор, концентрируется на объекте, находящемся на предметном столике. Часть прошедших через объект лучей попадает в объектив, преломляется в нем и дает увеличенное обратное действительное изображение объекта на уровне диафрагмы окуляра. Изображение объекта в плосковыпуклой линзе окуляра – мнимое прямое увеличенное. В целом объектив и окуляр дают обратное мнимое и увеличенное изображение объекта. Увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. В бактериологии обычно используют полезное увеличение в 900 раз (объектив – 90х, окуляр – 10х).

Для изучения объектов, которые меньше 0,2 мкм и обладают малой контрастностью, используют микроскопию в отраженном свете, подбирая для этого специальные темнопольные конденсоры (микроскопия в темнопольном микроскопе).

Живые и неокрашенные объекты позволяет изучать фазово-контрастная микроскопия путем повышения их контрастности (при прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении через неокрашенные – фаза световой волны, что используется для получения высококонтрастного изображения).

Люминесцентная микроскопия применяется для наблюдения за люминесцирующими (флюоресцирующими) микроорганизмами, обработанными специальными флюорохромами (флюоресцеин, родамин). Преимущество люминесцентной микроскопии перед световой состоит в ее более высокой разрешающей способности и быстроте выявления микроорганизмов, что привело к широкому использованию микроскопии этого вида для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний. Объекты или их части, не видимые в световой микроскоп, наблюдают в электронный микроскоп, используя вместо видимого света пучки электронов, а вместо стеклянных оптических линз – электромагнитные.

Реактивы и некоторые биологические препараты, используемые для приготовления питательных сред, изучения жизнедеятельности микроорганизмов, дезинфекции помещения лаборатории хранят в подвале или в темном стенном шкафу, где сухо, температура невысокая и без резких колебаний в течение года.

Оборудование рабочего места включает стол, покрытый стеклом (пластиком), на котором должны находиться бактериологическая петля, пинцет, банка с дезинфицирующей жидкостью и газовая (спиртовая) горелка. По окончании работы стол приводят в порядок и дезинфицируют. В микробиологической лаборатории должен храниться как минимум недельный запас дезинфицирующих средств. Дезинфицирующие растворы готовит лаборант или дезинфектор. На емкости с дезинфицирующим раствором должно быть указано его название, концентрация и дата приготовления.

Ежедневно помещение микробиологической лаборатории убирают влажным способом. Текущая уборка помещений в «чистой» зоне лаборатории проводится с применением моющих средств, а в заразной – с применением дезинфектантов.

Комнаты лаборатории, в которых проводится работа с патогенными биологическими агентами (ПБА): бактериями, вирусами, хламидиями, риккетсиями, простейшими, грибами, микоплазмами, генно-инженерно - модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения, гельминтами, а также с материалами, включая кровь и другие биологические жидкости и экскреты организма, подозрительными на содержание выше перечисленных агентов, оборудуются бактерицидными лампами. Лампы включают после проведения влажной уборки. Вход в помещение разрешается только после проветривания не ранее чем через 30 мин. При применении безозоновых бактерицидных ламп проветривание не требуется.

Лаборатория должна быть обеспечена водопроводом, канализацией, электричеством, отоплением и вентиляцией. При ориентации окон лаборатории на юг необходимо предусмотреть защиту рабочих столов от попадания прямого солнечного света путем использования светозащитных пленок или жалюзи из материала, устойчивого к дезинфектантам. На окна цокольного и первого этажей следует устанавливать металлические решетки, не нарушающие правил пожарной безопасности.

Лаборатория должна быть обеспечена средствами пожаротушения. Помещения микробиологической лаборатории должны быть непроницаемы для грызунов и насекомых.