Методы определения токсичности кормов

Токсичность пораженных грибами кормов определяют путем их скармливания чувствительным лабораторным животным, постановкой кожной пробы и др.

Метод кожной пробыпроводится путем апликации эфирной или спиртовой вытяжки исследуемого корма на оголенную кожу взрослого кролика с непигментированной кожей. Сущность метода заключается в проведении исследований на коже кролика, основанных на дерманекротическом действии токсичных веществ микогенного происхождения. У кролика на участке кожи размером 6 х 6 см в области бедра, лопатки или бока в день постановки пробы тщательно выстригают волосяной покров (до полного оголения). Повреждение кожи не допускается. Пигментированная кожа, а также кожа с признаками шелушения непригодна для проведения испытаний. На одном кролике допускается ставить одновременно не более четырех проб. Повторные использование кроликов для постановки пробы допускается лишь при отрицательных результатах предыдущих исследований.

На выстриженный участок кожи кролика стеклянной лопаткой наносят, слегка втирая, половину экстракта, вторую половину экстракта оставляют для повторного нанесения на следующий день. Небольшую часть оголенного участка кожи оставляют свободной от экстракта для контроля. Если экстракта недостаточно для двух нанесений, его предварительно разбавляют растительным маслом так, чтобы общее количество его было не менее 1 г.

Для предупреждения слизывания экстракта, нанесенного на кожу, на шею кролика надевают воротник, который снимают не ранее чем через 3 суток.

Наблюдение за реакцией начинают на следующий день после повторного нанесения экстракта и продолжают в течение 3-5 суток, в зависимости от степени токсичности корма.

Токсичность исследуемых кормов определяют по наличию воспалительного процесса на участке нанесения экстракта. Реакцию, развивающуюся на коже кролика после нанесения экстрактов из кормов или культур грибов (S.alternans,F.sporotrichiella,D.toxicum,Aspergillus) по глубине и характеру процесса делят на четыре степени.

Iстепень – покраснение, повышение чувствительности кожи, шелушение; вызывают очень слабо токсические корма и культуры грибов;

IIстепень – покраснение кожи, болезненность, незначительное утолщение кожи, мелкие, одиночные, с просяное зерно или меньше, желтоватые пузырьки, шелушение (вызывают слабо токсические корма и культуры грибов);

IIIстепень – покраснение, сильное утолщение, болезненность, складчатость кожи, на всей поверхности обработанного очага желтоватые пузырьки, поверхностный сухой некроз, иногда язвы, сплошной тонкий струп (обуславливают токсические корма и культуры грибов);

IVстепень – покраснение, сильный отек, выступающий в виде массивного вала на нижней границе очага нанесения экстракта, глубокий сухой некроз, захватывающий и подкожную клетчатку, нередко образование долго незаживающих ран; струп толстый, сплошной.

Нетоксичный корм– отсутствие воспалительной реакции. Допускается наличие гиперемии, сохраняющейся не более 2 суток после нанесения экстракта и не сопровождающейся шелушением кожи.

Слаботоксичный корм– гиперемия, сохраняющаяся 2-3 суток после нанесения экстракта, заканчивающаяся шелушением кожи, или гиперемия, болезненность, отечность, проявляющиеся незначительным утолщением кожи с последующим образованием отдельных чешуек. Этот корм подлежит специальной обработке.

Токсичный корм– резкая гиперемия, болезненность, складчатость, отек, проявляющиеся сильным утолщением кожи, по всей поверхности участка появляются язвы, затем сплошной струп. Такой корм использованию не подлежит. Дает положительную реакцию через 24-72 часа после повторного нанесения вытяжки.

Определение токсичности биопробой на инфузориях тетрахимена пириформис. Метод основан на экстракции из испытуемой пробы токсических веществ, в основном микогенного происхождения, с последующим воздействием водных растворов этих фракций на инфузории тетрахимена пириформис.

Исследование каждой пробы кормов проводят 3 раза. В трех флаконах для антибиотиков вносят по 1 см³экстракта, приливают 0,1 см³3-5 суточной культуры инфузорий тетрахимена пириформис и оставляют при комнатной температуре.

Через 30 и 60 мин подсчитывают эффект биопробы в капле, взятой пастеровской пипеткой, на предметном стекле под микроскопом увеличение (х7 – х10) просматривают весь объем капли и всех слоев. В исследуемых пробах подсчитывают наличие живых и погибших инфузорий, что зависит от степени токсичности корма. Наблюдение проводят на фоне контроля – пептоновая среда, все инфузории в контроле должны быть живыми. В случае гибели инфузорий контроль повторяют на новой среде и культуре.

Степень токсичности корма определяют по количеству живых инфузорий через 30 и 60 мин от начала испытаний: нетоксичный корм – гибели и никаких морфологических изменений в инфузориях не происходит в течение 60 мин наблюдений; слаботоксичный корм – морфологические изменения и частичная гибель (от 25 до 30%) гибель инфузорий в течение 60 мин наблюдений; токсичный корм – гибель всех инфузорий в течение 60 мин наблюдений.

Проба на бородках кур.Готовят спиртово-эфирные экстракты в соотношении 1:2 или 1:3. После этого экстракт разбавляют: к 0,5 мл экстракта добавляют 4,5 мл стерильного нейтрального рыбьего жира или подсолнечного масла. Перемешанный масляный экстракт вводят в одну из бородок курицы в дозе 0,1-0,2 мл. в другую бородку вводят экстракт из заведомо доброкачественного корма или масло. На месте введения экстракта из токсического корма отмечают воспаление, отек, кровоизлияние или даже некроз. Толщину бородки можно замерить кутиметром. Оценку реакции проводят по наличию изменений. Если диффузный отек бородки наступил через 4-24 часа, толщина ее увеличилась до 8 мм и больше, на вторые сутки в центре отека возникло кровоизлияние с последующим развитием некроза – реакция считается резко положительной. Когда же диффузный отек бородки возникает через 24 часа ее толщина достигает 5-8 мм, а кровоизлияние и некроз не развиваются – реакция положительная. В случае, если через 24 часа появляется только ограниченная припухлость бородки, а ее толщина не более 4 мм, реакция считается отрицательной.

Определение токсичности и токсигенности на цыплятах. Пробу корма растирают в ступке до размера частиц, свободно проходящих через толстую иглу шприца. Часть корма переносят в химический стакан и разводят водой до консистенции сметаны. Шприцом набирают 1-3 мл полученной суспензии и вводят внутрибрюшинно цыплятам недельного возраста (5 голов) опытной группы. Второй опытной группе цыплят (5 голов) вводят то же количество, охлажденной суспензии корма, но предварительно прокипяченной в течение 20-30 мин или автоклавированной. Цыплятам контрольной группы вводят аналогичное количество кипяченной воды. Каждого цыпленка помещают в отдельную клетку, обеспечивая свободный доступ к воде, но лишают корма на 1-2 суток, в течение которых отмечают общее состояние птиц. Случаи гибели выражают в процентах к общему числу цыплят, которым вводили исследуемый корм. Каждое 20% гибели оценивают по баллам: 100%-ая гибель (5 баллов) – корм очень высокотоксичен, 80% (4 балла) – корм высокотоксичен, 60% (3 балла) – корм токсичен, 40% (2 балла) – корм среднетоксичен, 20% (1 балл) – корм малотоксичен.

Проба на лабораторных мышах.Определить токсичность кимбинированных и других кормов также путем введения 0,5 мл экстракта мышам подкожно или в желудок зондом или шприцем с тугой иглой. При этом контрольной группе мышей вводят 0,5 мл нейтрального жира (подсолнечное масло, рыбий жир). От экстрактов резко токсичных кормов мыши погибают через 6-48 часов. Экстракты слаботоксичных кормов гибели животных не вызывают, однако на месте их введения устанавливают воспалительную реакцию, некроз.

Проба на рыбках гуппи.На рыбках можно определить токсичность зернофуражных (кроме комбикормов). Пробу зерна (50 г) тщательно измельчают на лабораторной мельнице, переносят в колбу (500 мл) с притертой пробкой и заливают 10 мл ацетона. Экстрагирование проводят при встряхивании на аппарате Сокслета в течение 2 часов, экстракт фильтруют через бумажный фильтр в фарфоровую чашку и выпаривают на водяной бане (50-60⁰С) под тягой. Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетона и переносят в стеклянную колбу, доливая туда 500 мл воды из аквариума. В колбу помещают 5 рыбок гуппи и наблюдают за ними в течение 24 часов, регистрируя результаты через 1, 2, 4, 8, 12 и 24 часа. Если корм не токсичен, за одни сутки погибает не более одной рыбки (до 20%), очень слаботоксичен через 12-24 часа 2-3 рыбки (40-60%), слаботоксичен – через 4-8 часов 4 рыбки (80%), токсичен – через 2-4 часа 5 рыбок (100%), резкотоксичен через 1 час 5 рыбок (100%). Контролем служит 1%-ный раствор ацетона, в котором рыбки должны оставаться живыми в течение трех суток.

Микотоксилогическое исследование.Для первичного выделения грибов из мучнистых, зерновых кормов используют обычно агаровую среду Чапека, а для выделения грибов из грубых кормов применяют метод посева во влажные камеры в чашки Петри на агар Чапека. Чашки Петри с посевами завертывают в стерильную бумагу, помещают в термостат, культивируют и выдерживают при температуре 22-25⁰ С в течение 7-10 суток. Рост и спороношение грибов становится заметным уже через 3 суток, однако для идентификации грибов необходимо большее время культивирования 5-7 суток. В мучнистых кормах подсчет колоний после посева начинают на 2-3 сутки. Для облегчения подсчета дно чашки размягчают карандашом на секторы или используют счетную камеру Вольфюгеля.

Микроскопическое исследование грибов, прежде всего непосредственно в чашках, пользуюсь только малым увеличением микроскопа. При этом выявляют наличие мицелиальных тяжей склероцитов плодовитых тел, строение и характер ветвления спорангиеносцев. Затем готовят препараты для детального изучения морфологии гриба. Частицы гриба в зависимости от вида берут из различных мест колоний, в старых частях колонии из центра, в более молодых – по краям. На предметное стекло наносят каплю фиксирующей жидкости. Затем иглой осторожно берут небольшое количество мицелия гриба, стараясь не повредить его, вносят в каплю жидкости, аккуратно снимая его другой иглой. Препарат накрывают покровным стеклом. С помощью малого (х8, х10), а затем большого (х40,х90) увеличения микроскопа изучают препараты, пользуясь специальными определителями с макроскопическими ключами, идентифицируют грибы.

Биопроба. Ее применяют как единственный метод подтверждения диагноза, когда микологическими исследованиями установлено наличие грибов в кормах, среди которых один вид какого-то гриба токсичен, а лабораторные методы исследования не дают положительного результата. Для установления токсичности такого корма его скармливают наряду с доброкачественным кормом двум группам (не менее трех голов в группе) животных. При постановке биопробы группы животных содержат изолированно. Контрольной группе скармливают заведомо доброкачественный корм. Ежедневно учитывают количество съеденного корма и ведут клинические наблюдения. При постановке биопробы следует учесть, что токсикоз проявляется быстрее, если пораженный корм скармливать подопытным животным на голодной желудок, т.е. после 5-6-часовой голодной диеты. Дачу воды не ограничивают. Биопроба считается положительной, если животные, которым скармливают исследуемый корм, заболевают или отказываются от него в то время, как животные контрольной группы ведут себя нормально. Положительными показателями биопробы при отравлении токсическими грибами считают: пониженный аппетит, поражение центральной нервной системы, нарушение координации движений, дрожь, угнетение или возбуждение, аборты, расстройство желудочно-кишечного тракта, скрежет зубами, стоматит, рвота у свиней, а также повышение температуры. Резко токсические корма могут вызывать гибель подопытных животных без проявления клинических признаков. Степень токсичности корма можно оценить, сравнивая результаты биопробы с таблицей.