Прямой и непрямой оптический тест Варбурга. Расчет ферментативной активности при определении по конечной точке и при кинетическом определении

В биохимии фотометрические измерения в большинстве случаев проводятся непосредственно при протекании биохимических реакций, в процессе которых потребляются субстраты, повышается концентрация продуктов реакций или меняются кофакторы реакций. Одним из самых распространенным оптических тестов является тест Варбурга, основанный на том, что один из продуктов дегидрогеназной реакции – восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотид или его фосфат (NADH или NADPH) – имеет максимум поглощения при длине волны 340 нм, а их окисленные формы при этой длине волны практически не поглощают (рис. 1.1.1).

Рис. 1.1.1. Спектры поглощении NAD⁺ (1) и NADН (2). Восстановление NAD⁺ до NADН прослеживается при 340 нм – максимуме поглощения NADН, при котором NAD⁺ не поглощает

Тест может быть использован для определения скоростей тех реакций, в которых не участвуют NAD⁺ или NADP⁺, но образующиеся продукты посредством других ферментативных реакций приводят к окислению NADH или восстановлению NAD⁺ (непрямой оптический тест Варбурга). При кинетическом определении вычисляют изменение поглощения за 1 мин и рассчитывают активность по формуле:

, где

А – активность фермента, измеряемая в международных единицах (МЕ или Ед или U). Каталитическая активность фермента выражается числом единиц, рассчитанных для 1 литра биологической жидкости (Ед/л).

V – объем реакционной смеси, мл;

1000 – коэффициент перерасчета миллимоль в микромоль;

l – длина оптического пути (1 см)

 – миллимолярный показатель поглощения NADH в реакции 6,22 л/(ммоль  см);

 – объем пробы (сыворотки крови или другого материала), мл;

D/t – изменение оптической плотности за 1 мин.

Реакция, сопровождающаяся изменением фотометрического сигнала, развивается за некоторый период времени и достигает определенного конечного состояния, так называемой конечной точки. Изменение сигнала, как функция времени, представлено на рис. 1.1.2.

Рис. 1.1.2. Измерение по конечной точке. Стрелками показаны моменты внесения буфера, реактива и биологической пробы

При измерении по конечной точке уровень сигнала соответствует количеству продуктов реакции в инкубационной среде после фиксированного времени инкубации. Поглощение измеряется после окончания реакции при стабильном значении сигнала.

Существует несколько схем измерения по конечной точке.

При работе на 2-х лучевом фотометре измерение ведется в режиме сравнения растворов в двух кюветах. В каждую кюветы вносится одинаковое количество реактива, затем в 1 кювету вносится с биопроба с известной концентрацией и получают стандартный раствор с известной концентрацией исследуемого вещества, а в другую кювету помещают количество воды или физиологического раствора, равное количеству биопробы, и получают таким образом опорный раствор (бланк).

Двухлучевая схема фотометрирования предусматривает автоматическое вычитание бланка, при этом фотоэлектрический сигнал бланка (оптическая плотность) принимается за нулевой отсчет оптической плотности, относительно которой и проводится 1-точечное измерение. Пример изменения сигнала при построении калибровочной кривой при измерении по конечной точке представлен на рис. 1.1.3. Измерение проводится по методу 1-точечного измерения (1 -point assay).

Рис. 1.1.3. 1-Точечное измерение. Сигнал развивается как функция времени для 6 стандартов. Исходная точка – нуль. Концентрация каждого стандарта измеряется 1 раз по конечной точке (по достижении стационарного уровня)

Кинетическое измерение подразумевает определение меняющейся в ходе реакции оптической плотности. Наиболее широко кинетическое измерение используется для определения активности ферментов, хотя в последнее время разработано достаточно много методов определения концентрации субстратов в период кинетического протекания реакций. Кинетическое измерение требует, наряду с соответствующим фотометрическим оборудованием, также точного поддержания температуры в измерительной кювете и правильного отсчета временных интервалов. Так, общепринятым считается поддержание температуры в измерительной ячейке в пределах ± 0,2° С. Эти условия являются обязательными для кинетических методов и доступны только при использовании современных фотометров и биохимических анализаторов. Что касается абсолютного значения температуры, то для определения активности ферментов используются 25°С, 30°С и 37°С. Температура 25°С является стандартной в физической химии, поэтому эта температура была предложена Комиссией по ферментам международного Союза по ферментам в 1961 г. В 1964 г. было предложено использовать 30°С, что связано с климатическими особенностями ряда стран и мнением о наибольшей стабильности результатов по определению активности ферментов при этой температуре. Однако в настоящее время большинство измерений в биохимических анализаторах проводится при 37°С.

Протекание кинетических реакций неоднозначное. На рис. 1.1.4 представлены типичные варианты протекания кинетических реакций. Существует несколько схем кинетического измерения.

Рис. 1.1.4. Скорость ферментативной реакции как функция времени. А – скорость постоянна в течение всего периода измерения, в любой период можно по скорости реакции оценивать активность фермента; Б – скорость реакции постоянно снижается, рекомендуется активность фермента оценивать по начальной скорости; В – линейный участок, в течение которого рекомендуется определять активность фермента, устанавливается в середине периода инкубации

В случае постоянной скорости кинетической реакции (рис. 1.1.4, А) измерение можно проводить на любом отрезке линейной кривой, приводя измерение поглощения к I минуте. Расчет ведут по формуле:

Достоинством данного способа является простота, возможность измерения без использования стандарта, а также независимость в пределах линейного диапазона плотностей от влияний системных интерферирующих факторов. Кинетический способ измерения допустим при использовании вымытых пластиковых кювет, которые предназначены для разового использования в биохимических анализаторах, так как оптическая плотность меняется на определенное значение в любой промежуток времени и не зависит от величины оптической плотности холостой пробы. Однако необходимо убедиться, что измерение проводится в линейном диапазоне протекания кинетической реакции.

Двухточечное измерение потенциально включает возможность нескольких методических ошибок. Если реакция начинается с очень высокой скоростью, то она может замедлиться или вообще прекратиться из-за потребления всего количества субстрата. Выявить такую погрешность при 2-х точечном измерении не представляется возможным. На ошибку указывает несоответствие результатов биохимического исследования клиническим данным. Реакция вообще может иметь нелинейный характер.

Реакция может задержаться на старте (Lag фаза в мультиферментных тестах, рис. 1.1.4, В). Наличие Lag фазы, как правило, объясняют выравниванием температуры и задержкой для равномерного перемешивания пробы с реактивом, однако основное значение имеет, по-видимому, задержка для образования комплекса субстрата [S] с ферментом [Е], поэтому Lag фаза может продолжаться до нескольких минут. При кинетических исследованиях существенное значение имеет порядок внесения реактивов. Считается правильным для лучшего перемешивания реактив большего объема добавлять к меньшему объему, в измерительную кювету сначала вносится биопроба (меньший объем), а затем рабочий реактив (больший объем), то есть, стартуют реактивом.

В биохимии для измерений, в которых регистрируется более 2 точек, принят термин “кинетическое” измерение, хотя 2-х точечное измерение также кинетическое. Непрерывное (многоточечное) измерение оптической плотности в ходе реакции позволяет оценивать характер кинетики и выбирать для расчетов линейный участок кривой. Многократное измерение прироста концентрации продукта реакции (снижения субстрата, либо изменения состояния кофермента) считается наиболее точным методом определения активности ферментов. Изменение оптического поглощения в этом случае должно быть одинаковым за равные промежутки времени (допуск отклонений от линейности не должен превышать 10 %).