Осаждение белков

Классическим методом разделения белков является метод их разделения на основе различной растворимости. Для осаждения необходимо понизить каким-либо способом растворимость белка. В целом растворимость белков зависит от их способности к гидратации. У глобулярных водорастворимых белков высокий уровень гидратации обеспечивается расположением гидрофильных групп на поверхности. Добавление органических растворителей понижает степень гидратации и приводит к осаждению белка. Принцип такого метода заключается в том, что по мере возрастания концентрации органического растворителя снижается способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул фермента. Происходит снижение растворимости белков до уровня, при котором начинается их агрегация и осаждение. Важным параметром, влияющим на осаждение, является размер молекулы белка. Чем больше молекула белка, тем ниже концентрация органического растворителя, вызывающая осаждение белка.

Осаждают белки также с помощью солей, например, сульфата аммония. Этот способ называют высаливанием. Высаливание при добавлении необходимого количества соли – эффективный способ концентрирования. Принцип этого метода основан на том, что при повышении концентрации соли в растворе происходит сжатие ионных частиц, образуемых противоионами белка, что способствует сближению их до критического расстояния, на котором межмолекулярные силы ван-дер-ваальсова притяжения перевешивают кулоновские силы отталкивания противоионов. Это приводит к слипанию белковых частиц и их выпадению в осадок.

Для выделения белков применяют также метод изоэлектрического осаждения. Заряд белков обусловлен в первую очередь остатками аспаратата и глутамата (отрицательный заряд) и остатками лизина и аргинина (положительный заряд). По мере повышения рН различными способами заряд белков изменяется от положительных до отрицательных значений и в изоэлектрической точке оказывается равен нулю, вследствие чего белок лишается своей ионной атмосферы и его частицы слипаются, выпадая в осадок.

Выпавший осадок белка отделяют фильтрацией или центрифугированием. Частицы осажденного вещества под действием центробежной силы оседают на дне центрифужных стаканов и сжимаются в плотный осадок. Скоростные центрифуги (ультрацентрифуги) создают центробежное ускорение порядка 100000g, что позволяет осаждать крупные надмолекулярные агрегаты – рибосомы и вирусы.