Лекция 4.3 ковалентная модификация ферментов и ее типы

Ковалентная модификация ферментов – тип регуляции ферментативной активности под действием других ферментов, осуществляющийся за счет присоединения к белковой молекуле небольших химических групп, что вызывает конформационные изменения в молекуле белка, приводящие к изменению определенной геометрии каталитического центра. Является быстрым механизмом регуляции активности ферментов внешними сигналами. Ковалентная модификация является основным механизмом при рецептор-зависимом ответе клеток на внешние воздействия, тогда как аллостерические эффекторы изменяют активность ферментов в ответ на изменение внутриклеточных условий.

Фосфорилирование – наиболее распространенный тип ковалентной модификации, является АТФ-зависимым процессом и осуществляется с помощью ферментов протеинкиназ. В большинстве случаев фосфорилированная форма фермента более активна, чем нефосфорилированная. Фосфорилирование модифицирует белки добавлением отрицательно заряженных остатков фосфорной кислоты к гидроксильным группам остатков серина, треонина и, реже, тирозина.

Рис. 4.3.1. Фосфорилирование/дефосфорилирование.

Возвращение фермента в исходное состояние осуществляется ферментами протеинфосфатазами, которые отщепляют неорганический фосфат от молекулы белка.

В некоторых случаях фосфорилирующие и дефосфорилирующие белки сами являются модифицируемыми ферментами. Активность протеинкиназ и протеинфосфатаз находится под гормональным контролем и регулируется нервной системой.

К ковалентной модификации ферментов помимо фосфорилирования относятся также аденилирование, уридилирование, ацетилирование, АДФ-рибозилирование.

Ковалентную модификацию аденилированием и уридилированием можно рассмотреть на примере регуляции активности фермента глутаминсинтетазы. Глутаминсинтетаза выполняет одну из ключевых функций в обмене азота у бактерий E. Coli. При выращивании Е. coli на среде, в ко­торой источником азота служит не NH₄⁺, а другие соеди­нения, в клетках наблюдается высокий уровень глутаминсинтетазной активности. Добавление в ростовую среду солей NH₄⁺ вызывает быстрое (в течение минуты) десятикратное снижение активности фермента, которое нельзя объяснить подавлением его синтеза. Попытки объяснить данное явление привели к открытию фермента, катализирующего инактивацию глу­таминсинтетазы in vitro в присутствии АТФ, Mg²⁺ и глутамина. Далее было установлено, что разные формы фермента содержат различные количества ковалентно связанной АМФ. Далее было установлено, что инактивирующий белок является аденилилтрансферазой, катализирующей ковалентное присоединение АМФ к определенной тирозильной группе в каждой из 12 субъединиц глутаминсинтетазы. Однако полное превращение происходит только в экстремальных условиях, например когда клетки, выра­щенные в условиях недостатка NH₄⁺, попадают в среду, богатую этим соединением. Обычно глутаминсинтетаза находится в промежуточных состояниях аденилирования, в которых аденилированными являются лишь некоторые из 12 субъединиц.

Активность отдельной субъединицы в составе олигомера зависит от состояния соседних субъединиц (аденилированы они или не аденилированы), вероят­но, из-за аллостерического влияния, которое передается через межсубъединичные контакты.

При переносе Е. coli из среды, богатой NH₄⁺, в бедную этим соединением среду происходит быстрая реактивация глутаминсинтетазы, что указывает на обратимость процесса аденилирования. Было установлено, что активность аденилилтрансферазой регулируется с помощью уридилирования и деуридилирования. Уридилирование происходит в результате катализируемого специфичной уридилилтрансферазой ковалентного присоединения УМФ к одному или двум тирозильмым остаткам каждой субъединицы аденилилтрансферазы. Деуридилирование катализируется уридилил-отщепляющим ферментом. Уридилирующий и деуридилирующий ферменты образованы одним полипептидом, который, подобно аденилилтрансферазе, проявляет бифункциональные свойства.

Примером ковалентной модификации белков с помощью ацетилирования является модификация гистонов. Ацетилирование гистонов играет важную роль в модуляции структуры хроматина при активации транскрипции, увеличивая доступность хроматина для транскрипционного аппарата. Гистоны целенаправленно модифицируются на тех промоторах, которые требуется активировать. Ацетилированию и деацетилированию подвергаются определенные остатки лизина, что осуществляется с помощью ферментов ацетилтрансфераз и деацетилаз. Предполагается, что ацетилированные гистоны менее прочно связаны с ДНК и поэтому ацетилирование может облегчать доступ и связывание факторов транскрипции с их элементами узнавания на ДНК. Ацетилирование остатков лизина в N-концевых «хвостиках» гистонов H2A, H2B, H3 и H4 нейтрализует их положительный заряд и соответственно блокирует ассоциацию с витками нуклеосомной ДНК. Это, в свою очередь, декомпактизует структуру как самой нуклеосомы, так и хроматина в целом и освобождает внешнюю поверхность витков ДНК для взаимодействий с регуляторными факторами.

Еще одним способом химической модификации ферментов с помощью присоединения небольших химических групп является АДФ-рибозилирование. АДФ-рибоза может вызывать неэнзиматическое АДФ-рибозилирование ряда белков. К ним относятся белки регулирующие репарацию ДНК, белки-регуляторы трансляции и агрегации тромбоцитов. Моно-АДФ-рибозилирование – посттрансляционный процесс модификации белков, ответственный за токсический эффект некоторых бактериальных токсинов. Действие коклюшного или холерного токсинов вызывает моно-АДФ-рибозилирование белков плазмати­ческой мембраны и может изменять работу сигнальных систем или активность мембранного транспорта в результате нарушения функционирования G-белков. Схематически действие холерного токсина можно описать следующим образом (Рис. 4.3.2). В норме ГТФ, связанный с Gsα быстро гидролизуется (синяя стрелочка), так, что активация аденилатциклазы и увеличение цАМФ происходит столь долго, сколько гормон связан с рецептором. В присутствии холерного токсина Gsα необратимо модифицируется АДФ- рибозилированием, так, что она может связывать ГТФ, но не может его гидролизовать (красные стрелочки). В результате постоянной активации происходит нерегулируемый рост уровня цАМФ.

Рис. 4.3.2. Механизм действия холерного токсина

При нормальных условиях АДФ-рибозилированию могут подвергаться актин, десмин, интегрин-α-7.

Рис. 4.3.3. АДФ-рибоза

Аденилатциклаза

Аденилатциклаза (АТФ -пирофосфатлиаза циклизирующая) фермент, класса лиаз, катализирует гидролиз АТФ с образованием цАМФ и пирофосфата.

Mg²⁺ АТФ  цАМФ + H₄P₂O₇

Рис. 4.3.4. структура цАМФ

Аденилатциклаза обнаружена практически во всех тканях животных, а также у бактерий. В клетках животных он локализован в плазматических мембранах, у бактерий – в мембранах и цитоплазме. Наиболее существенная роль цАМФ состоит в активации цАМФ – зависимых протеинкиназ (протеинкиназы А).

Рис. 4.3.5. Первичная структура аденилатциклазы

Рис. 4.3.6. Расположение аденилатциклазы в мембране

Фосфолипаза С

Фосфолипаза С является ключевым ферментом фосфоинозитидной мессенджерной системы. Многочисленные внеклеточные сигнальные молекулы (гормоны, нейромедиаторы, факторы роста, иммуноглобулины, антигены и др.), при взаимодействии со своими рецепторами вызывают активацию фосфолипазы С (ФЛC). При взаимодействии лиганда с рецептором активурующий ФЛC сигнал может передаваться специальным G-белком (G_q). Активированная ФЛC катализирует расщепление мембранного фосфолипида фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата (ФИФ2) на инозитолтрифосфат (ИФ3) и диацилглицерол (ДАГ). Диацилглицерол связывается и стимулирует протеинкиназу С (ПKC), ИФ3 взаимодействует с активируемым им Са²⁺ каналом (ИФ3 рецептором), в результате чего происходит выход ионов кальция из эндоплазматического ретикулума, которые участвуют в активации Са²⁺ - кальмодулин-зависимых протеинкиназ, протеинкиназы С и многочисленных кальций-чувствительных белков. Таким образом, в отличие от других ферментов, катализирующих образование вторичных мессенджеров, ФЛС использует компоненты самой мембраны.

Рис. 4.3.7. Действие фосфолипазы С на фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат

Протеинкиназы, типы

Протеинкиназами называют ферменты, катализирующие перенос фосфата от АТФ к специфическому аминокислотному остатку (серину, треонину, тирозину и т.д.). Протеинкиназы эукариот представляют собой суперсемейство гомологичных белков. Важнейшими представителями этого семейства являются серин-треониновые протеинкиназы и тирозиновые протеинкиназы.

Протеинкиназа А, регуляция активности цАМФ

Протеинкиназа, активность которой регулируется цАМФ, называется протеинкиназой А (ПКА). ПКА представляет собой тетрамер, состоящий из двух регуляторных (R) и двух каталитических (C) субъединиц, образующих четвертичную структуру типа R2C2. Регуляторный димер является мишенью для цАМФ. Каталитические субъединицы у разных цАМФ-протеинкиназ не идентичны. Они различаются прежде всего специфичностью в отношении белковых субстратов. При связывании цАМФ происходит диссоциация холофермента на регуляторный димер и две каталитические субъединицы. Для освобождения одной каталитической субъединицы необходимо связывание 2-х молекул цАМФ с одной регуляторной субъединицей. Холофермент не обладает каталитической активностью. После отщепления от регуляторной субъединицы, оказывающей ингибирующее влияние, каталитическая субъединица приобретает протеинкиназную активность. Она фосфорилирует белки по серину и треонину. Ковалентное фосфорилирование этих остатков регулирует активность этих белков.

Концентрация ПКА в клетках млекопитающих достаточно высока, чтобы связать практически весь цАМФ и сделать его недоступным для гидролиза фосфодиэстеразой. Однако при диссоциации комплекса связывание цАМФ с регуляторной субъединицей ослабевает, цАМФ диссоциирует и становится доступной для фосфодиэстеразы, активность которой к тому же усиливается фосфорилированием ПКА. Фосфодиэстераза может ингибироваться кофеином, что ведет к внутриклеточному накоплению цАМФ. Возврат системы в исходное, не активированное состояние происходит после дефосфорилирования белков соответствующими фосфатазами.

Рис. 4.3.8. Переход протеинкиназы А из неактивного состояния в активное, посредством связывания цАМФ

Протеинкиназа С, регуляция активности диацилглицеролом, фосфолипидами и ионами кальция

Протеинкиназа C (ПКС) - Серин/Треонин-специфическая протеинкиназа - экспрессируется практически во всех клетках млекопитающих. Ее субстратами в различных клетках служат ядерные белки, белки цитоскелета, ферменты. Для проявления активности ПКС нужны ионы Са²⁺ и фосфолипиды (фосфатидилсерин). Дополнительная стимуляция ПКС происходит под действием диацилглицерола (ДАГ), образующегося при действии фосфолипазы С. ДАГ активирует ПКС путем увеличения ее сродства к Са²⁺ и фосфолипидам.

В неактивированном состоянии ПКС находится в цитозоли. При ее стимуляции происходит транслокация фермента к мембране, элементам цитоскелета или ядру. В мембране образуется комплекс вида ПКС-ДАГ- Са²⁺ - фосфатидилсерин. В этом виде протеинкиназа С проявляет свою активность.

Показано, что одни и те же процессы можно вызвать как повышением Са²⁺ c помощью ионофоров, так и путем активации эндогенной протеинкиназы С с помощью форболовых эфиров, являющихся аналогами ДАГ.

Обратимость процесса ковалентной модификации. Протеинфосфатазы

Обратный процесс ковалентной модификации является таким же важным, как и прямой процесс. В случае если возврата в исходное состояние не происходит то сигнальная система остается во включенном состоянии, что может привести к фатальным последствиям.

Процесс фосфорилирования белков протеинкиназами является обратимым за счет присутсвия ферментов протеинфосфатаз. Как правило, дефосфорилирование возвращает белки обратно в состояние покоя. Однако существует ряд белков (например, гликогенсинтаза), которые в состоянии покоя фосфорилированы, а в активное состояние переходят после процесса дефосфорилирования. В эукариотической клетке около 30% процентов белков подвергаются фосфорилированию. Обратимое фосфорилирование белков, катализируемое протеинкеназами и протеинфосфатазами, регулирует многие внутриклеточные процессы.

Специфические рецепторы: серпентиновые и тирозинкиназные рецепторы

Большинство рецепторов, передающих свое действие на G-белки, относятся к серпентиновым рецепторам и локализованы они, главным образом, в плазматической мембране. Полипептидная цепь этих белков включает семь трансмембранных тяжей. N-конец молекулы рецептора расположен во внеклеточном пространстве и имеет участки, по которым происходит N-гликозилирование. C-концевой фрагмент, обращен внутрь клетки. Уникальная структура лиганд-связывающих участков серпентиновых рецепторов позволяет связывать лиганды различной природы и молекулярной массы. Первичными сигналами для этих рецепторов служат разнообразные молекулы, среди которых низкомолекулярные гормоны и нейромедиаторы (например, адреналин, норадреналин), гормоны пептидной и белковой природы (например, глюкагон), некоторые нейропептиды.

Рецепторные протеинкиназы фосфорилирующие белки по тирозиновым остаткам (а не остаткам серина или треонина, как другие ПК), относят к тирозинкиназам и называют тирозинкиназными рецепторами. Через тирозинкиназы опосредуется действие факторов роста клеток, цитокинов и инсулина. Тирозинкиназные рецепторы фосфорилируют внутриклеточные субстраты, проводя сигналы, управляющие важными клеточными реакциями: пролиферацией, дифференцировкой , метаболизмом и генной экспрессией. Семейство тирозин-специфических протеинкиназ относится к каталитическим белкам-рецепторам, однократно пронизывающим мембрану. Каталитический домен находится с внутренней стороны плазматической мембраны. При связывании лиганда они активируются и переносят фосфатную группу от АТФ на гидроксильную группу тирозинового остатка в определенных белках, либо происходит аутофосфорилирование. Связывание лиганда вызывает конформацию рецептора, что приводит к его димеризации, после чего субъединица с киназной активностью фосфорилирует по тирозину субъединицу соседнего рецептора вблизи каталитического участка. Фосфорилированный димер представляет собой каталитически активный рецептор.

Рецепторы – ионные каналы

Рецепторы данного типа являются олигомерными мембранными белками, состоящие из нескольких субъединиц, полипептидная цепь которых неоднократно пересекает наружную клеточную мембрану и образующими лиганд-активируемый ионный канал. Связывание лиганда ведет к открыванию канала для различных ионов. Эти рецепторы как правило отвечают за передачу сигнала через синапсы в электрически возбудимых клетках. Ионные каналы этих рецепторов характеризуются тремя основными состояниями: 1) закрытое состояние (в отсутствие внешнего сигнала); 2) открытое (активированное) состояние (лиганд связан с рецептором); 3) инактивированное (закрытое) состояние, может наступать, когда лиганд еще связан с рецептором.

Рис. 4.3.9. Действие рецепторов ионных каналов

Каскадный механизм регуляции активности гликогенфосфорилазы и гликогенсинтазы гормонами

Основными гормонами, влияющими на активность гликогенфосфорилазы и гликогенсинтазы через каскадный механизм являются глюкагон и адреналин.

Глюкагон – пептидный гормон, вырабатывается α-клетками поджелудочной железы. Вырабатывается в ответ на снижение концентрации глюкозы в крови.

Адреналин – вырабатывается в мозговом слое надпочечников, является гормоном стресса и тревоги.

Адреналин и глюкагон взаимодействуют со специальными рецепторами, находящимися на поверхности клетки, которые опосредованно через G-белки вызывают активацию аденилатциклазы и стимулируют синтез цАМФ.

Так, гликогенфосфорилаза в покое в клетке находится в неактивном, дефосфорилированном состоянии и при гормональном воздействии происходит ее активация. Гликогенсинтаза при фосфорилировании переходит в неактивное состояние.

Рис. 4.3.10. Каскадный механизм регуляции активности гликогенфосфорилазы и гликогенсинтазы гормонами. Н – гормон, R – рецептор, Gs – G-белок, АЦ – аденилатциклаза, ПКА – протеинкиназа А, Киназа ГФ – киназа гликогенфосфорилазы, ГФ – гликогенфосфорилаза, ГС – гликогенсинтаза.

Регуляция с помощью белок-белковых взаимодействий (присоединение или отщепление регуляторных субъединиц или белков-регуляторов).

Активность многих ферментов может регулироваться через обратимое связывание с регуляторными субъединицами (например, протеинкиназа А) и связывание белков-регуляторов, таких как Ca²⁺ – кальмодулин. G-белки активируют белки-мишени, через обратимое связывание. Регуляторные белки связываются с другими белками и регулируют их активность, вызывая конформационные изменения в активном центре, либо блокируя активный центр. Ca²⁺ – кальмодулин является примером диссоциирующего регуляторного белка, который свяывается с большим количеством различных белков и изменяет их активность. Одним из белков, активируемых Ca²⁺ –кальмодулином является мышечная киназа гликогенфосфорилазы, которая также активируется гликогенфосфорилазой А. Под действием нервного импульса в мышце происходит высвобождение ионов кальция. Ca²⁺ связывается с субъединицей кальмодулина в мышечной киназе гликогенфосфорилазе, что вызывает в ней конформационные изменения, увеличивающие ее активность. Активированная киназа фосфорилаза фосфорилирует гликогенфосфорилазу, что приводит к расщеплению гликогена и усилению образования АТФ в клетке.

Некоторые ферменты синтезируются в форме неактивных предшественников, называются зимогенами, активируются путем ограниченного протеолиза (например, химотрипсин). Ограниченный протеолиз является одним из распространенных методов перевода неактивной формы белковой молекулы в форму, проявляющую каталитическую активность. При протеолитическом отщеплении определенного участка молекулы высвобождается активный центр, изменяется его строение и т.д. Такой механизм широко распространен для клеточный протеаз. В ряде случаев ограниченный протеолиз обеспечивает подавление биологической активности ферментов.

Регуляция активности аденилатциклазы, киназы гликогенфосфорилазы.

Аденилатциклазы – гормон-регулируемые ферменты, интегральные белки мембран. К_м^АТФ аденилатциклазы имеет порядок 10^-4 М, таким образом при физиологических концентрациях АТФ (10^-3 М) она функционирует в оптимальных условиях. ΔG^0’ = -58,9 кДж/моль, что соответствует по уровню АТФ или ФЕП и говорит о смещении равновесия в реакции в право.

Регуляция активности аденилатциклазы включает как внеклеточные так и внутриклеточные сигналы. Регуляция активности аденилатциклазы вследствие воздействия на клетку внешнего сигнала осуществляется через специфические рецепторы, действие которых опосредуется специальными G-белками, которые, в свою очередь, в присутствии ГТФ влияют непосредственно каталитическую единицу аденилатциклазы. Аденилатциклаза активируется α-субъединицей Gs-белков, соответственно α-субъединица Gi-белков оказывает ингибирующее действие.

Для проявления активности аденилатциклазы необходимо присутствие ионов Mg²⁺, которые могут быть заменены на Mn²⁺ или Co²⁺. Ионы Ca²⁺ обладают свойствами конкурентных ингибиторов. Пирофосфат также оказывает ингибирующее действие.

Разные типы АЦ различаются по чувствительности к гормонам, Ca2+, β/γ-комплексу G-белков, кальмодулину и форскалину (кардиоактивному дитерпену).