Раздел 5. Прикладное значение ферментов лекция 5.1. Генетическая инженерия ферментов

Генетическая инженерия ферментов представляет собой искусственное создание ферментов с использованием методов генной инженерии: технологий рекомбинантных ДНК или молекулярного клонирования. С помощью генетической инженерии могут создаваться:

• ферменты, называемые рекомбинантными ферментами (аналогичные природным либо модифицированные);

• клетки, экспрессирующие ферменты, – рекомбинантные клетки (фермент может быть необходим не в изолированном виде, а в виде экспрессирующих его клеток);

Технологии рекомбинантных ДНК

Основу генной (или генетической) инженерии составляют технологии рекомбинантных ДНК. Рекомбинантные ДНК – это искусственно созданные молекулы ДНК, представляющие собой гены (фрагменты ДНК), встроенные в специальные молекулы ДНК (векторы), которые могут обеспечить увеличение копий гена, а также его экспрессию. Умножение гена происходит вместе с делящимися клетками ‒ клоном, несущим рекДНК, поэтому технологии рекомбинантных ДНК также называют молекулярным клонированием.

Основные этапы молекулярного клонирования

Основными этапами молекулярного клонирования являются следующие процедуры:

Кроме перечисленных основных этапов могут присутствовать и дополнительные. Так ген, кодирующий фермент, может быть подвергнут модификациям, в частности, сайт-специфическим изменениям с целью изменения свойств фермента. В процессе создания экспрессионной системы могут быть использован ряд подходов для увеличения эффективности экспрессии – оптимизация экспрессии клонированных генов.

Последний этап молекулярного клонирования зависит от его целей. Если конечным продуктом является сам фермент, то он выделяется из клеток и подвергаться очистке. Может также использоваться реакция, катализируемая ферментом в виде рекомбинантных клеток.

В зависимости от того, какие клетки используются для молекулярного клонирования, выделяют прокариотические и эукариотические системы. Эти системы различаются используемыми векторами и регуляторными элементами. Прокариотические системы более просты. Поэтому, если применение клонирования в бактериальных клетках возможно, то предпочтительно используются они. Однако из-за специфических особенностей экспрессии синтеза эукариотических ферментов часто прокариотические системы использовать невозможно. В таких случаях необходимы эукариотические системы.

На сегодняшний день генетическая инженерия представляет быстро развивающуюся область науки и технологий и ее рассмотрению может быть посвящен целый отдельный курс. Поэтому нижеприведенное описание этапов генно-инженерных манипуляций представляет собой только краткое их описание.

Получение гена, кодирующего фермент

Необходимый ген, кодирующий фермент может быть получен несколькими способами:

• химическим синтезом,

• синтезом методом ПЦР (полимеразной цепной реакции),

• выделением из геномной ДНК,

• синтезом с мРНК.

Синтезировать химическим путем удается относительно небольшие фрагменты ДНК, кодирующие небольшое число аминокислот. С разработкой и внедрением ПЦР этот метод стал все более активно использоваться и для синтеза генов.

Получение гена из геномной ДНК производится с использованием сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции, называемых рестриктазами. Эти ферменты сыграли огромную роль в развитии генной инженерии. Рестриктазы разрезают двойную спираль по специфическим последовательностям из 4-8 нуклеотидов. Они могут вносить тупой или ступенчатый разрез.

Под действием рестриктаз, вызывающих ступенчатые разрывы, на обоих концах фрагмента ДНК образуются короткие одноцепочечные участки. Их называют “липкими концами”. Они способны к комплементарному взаимодействию с другим концом, образовавшимся под действием одного и того же фермента. Это используется для встраивания гена в вектор. Необходимо отметить, что способ получения гена из геномной ДНК, путем разрезания всей геномной ДНК с помощью рестриктаз приводит к тому, что клонируется огромное количество фрагментов. Это ведет к большому объему работы на этапе клонирования.

Ген может быть получен с помощью синтеза фрагмента ДНК с матричной РНК с использованием обратной транскриптазы. Такие фрагменты называют кДНК (комплементарными ДНК). Этот способ обладает следующими преимуществами: фракция мРНК, выделяемая из клеток представляет собой копии только активных – экспрессирующихся генов, в то время как геномная ДНК содержит большой объем неэкспрессируемых последовательностей. Кроме того, кДНК лишены интронов. Это может быть очень актуальным при клонировании эукариотических генов в прокариотических системах.

Вставка гена в вектор

Ген вводится в специальные молекулы ДНК, которые обеспечивают функционирование гена в новой генно-инженерной системе. Генетические элементы, используемые для создания рекомбинантной ДНК и введения ее в клетку, называют векторами. В качестве векторов чаще всего используют вирусы и плазмиды.

Плазмидные векторы созданы на основе природных бактериальных плазмид. Они представляют собой небольшие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК. Такие векторы способны автономно реплицироваться благодаря наличию точки инициации репликации (ori). Плазмиды, которые используются в генной инженерии, содержат селективные маркеры. В качестве селективных маркеров часто используются гены устойчивости к антибиотикам. Обычно векторная молекула несет более одного селективного маркера. Благодаря таким маркерным генам на последующих этапах клетки, несущие рекомбинантную плазмиду, легко отделить от клеток, не имеющих такой рекДНК.

Вставка гена в вектор, т.е. создание рекДНК осуществляется стандартно с использованием рестриктаз. Векторная молекула, кроме ori и селективных маркеров должна нести уникальные сайты рестрикции для нескольких рестриктаз. Уникальный сайт рестрикции обеспечивает то, что при обработке соответствующей рестриктазой кольцевая молекула будет разрезана в одном строго определенном месте и превратится в линейную. При соединении клонируемого гена и вектора, обработанных одной и той же рестриктазой, эти молекулы могут соединяться в одно целое путем спаривания оснований «липких концов». Полученная молекула ДНК (вектор со встроенным геном) называется рекомбинантной (рекДНК). Соответственно, кодируемые рекомбинантными ДНК ферменты называют рекомбинантными ферментами, а клетки, экспрессирующие такие ферменты (или другие белки) – рекомбинантными клетками или рекомбинантными системами.

Трансформация клеток рекомбинантными ДНК

Рекомбинантные кольцевые молекулы ДНК вводят в клетки (обычно бактериальные или дрожжевые), то есть трансформируют плазмидами. Для этого их делают временно проницаемыми для ДНК. Для повышения проницаемости клеток их обрабатывают ионами Ca²⁺ на холоду или обрабатывают электрическим током (процедура носит название электропорации). Если используется рекДНК, созданная на основе вирусного вектора, то процедура введения рекДНК в клетки носит название трансфекции.

После трансформации/трансфекции клеткам предоставляются оптимальные условия для размножения. Далее клетки высевают на плотную питательную среду для того, чтобы каждая клетка дала клон.

Отбор клонов

Все клетки одного клона генетически однородны и могут быть нескольких вариантов:

• не содержать рекДНК,

• содержать вектор без вставки гена;

• содержать рекДНК.

Для того, чтобы выявить клоны, содержащие рекДНК используется отбор на основе селективных маркеров. Так, когда в качестве селективных маркеров используется гены устойчивости к антибиотикам, клетки высевают на селективную питательную среду, содержащую соответствующий антибиотик. В таком случае расти будут только те клетки, которые имеют вектор с геном устойчивости. Чтобы выявить клетки, несущие не просто вектор, а рекДНК, используется отбор на основании второго маркера.

В случае клонирования фрагментов, полученных из геномной ДНК или кДНК получают набор клонов, несущих рекДНК с различными вставками – библиотеки геномной и кДНК. Для отбора клона с нужным геном из библиотеки используется гибридицация нуклеиновых кислот или анализ с помощью антител к белковому продукту клонированного гена.

Функционирование гена в клетке-реципиенте (адаптация гена)

Плазмида, попадающая в клетку-хозяин и придающая ей новые свойства является нестабильным образованием. Возможна ее деструкция под действием нуклеаз. Кроме того, на ее стабильность оказывает влияние динамика роста всей клеточной популяции. Выявляются определенные кинетические закономерности репликации плазмид. Число плазмид на клетку не является постоянным, а закономерно изменяется в процессе роста популяции. При этом все наблюдаемые случаи могут быть разделены на два типа – монофазные и двухфазные процессы (рис.5.1.1). В первом случае клетки временно теряют некоторое количество плазмид. Второй случай более сложен: уменьшение числа плазмид на начальном этапе в последующем сопровождается их гиперпродукцией.

Считается, что особенности кинетики репликации плазмид первого и второго типа обусловлены наличием периода индукции в случае плазмид второго типа.

Оптимизация экспрессии клонированных генов

Увеличение числа копий рекДНК в клетках

Для повышения экспрессии используется повышения числа копий рекомбинантного гена в клетке. Использование мультикопийных векторов – т.е. векторов, которые реплицируются в клетке независимо от хозяйской ДНК, позволяет эффективно амплифицировать рекДНК в клетке-хозяине. Однако есть опасность возникновения состояния метаболической перегрузки в клетках, непосредственного токсического действия рекомбинантного белка. В этих условиях при экспрессии рекомбинантного белка может возникать частота трансляционных ошибок. Это может иметь нежелательные последствия при использовании рекомбинантного продукта, например, в случае использования фермента в качестве лекарственного препарата при введении в организм человека может возникать иммунная реакция.

Рис.5.1.1. Изменение во времени числа клеток (а) и числа копий различных плазмид в клетках E.coli (б, с)

Использование экспрессионных векторов

Для обеспечения эффективной экспрессии клонированного фермента используется ряд приемов. Одним из них служит использование специальных экспрессионных векторов. Такие векторы содержат необходимые последовательности промоторов, терминаторов для эффективной транскрипции.

Кроме того, сконструированы и используются специальные трансляционные экспрессионные векторы, включающие последовательность Шайна-Дальгарно для эффективного связывания мРНК с рибосомами.

Использование сильных, контролируемых промоторов

Экспрессионные векторы содержат сильные промоторы, под контроль которых попадает клонированный фрагмент. Такой промотор имеет высокое сродство к РНК-полимеразе.

Непрерывная экспрессия чужеродного гена может оказаться губительной для клетки-хозяина, поскольку происходит истощение ресурсов клетки. Поэтому необходимо, чтобы сильный промотор был контролируемым. Кроме того важно, чтобы ген экспрессировался в определенную фазу клеточного цикла. Например, промотор может контролироваться температуро-чувствительным репрессором. В этом случае при температуре 28-30^оС такой регулятор блокирует транскрипцию с промотора. Когда культура достигает нужной фазы (обычно середины логарифмической фазы роста) температуру повышают до 42^оС, при которой репрессор инактивируется и начинается экспрессия. Экспрессионные системы должны включать, соответственно, и ген репрессора, который часто помещается в другой вектор.

Рефолдинг выделенного белка

Иногда биосинтез целевого белка происходит настолько быстро и его концентрации настолько высоки, что белок может агрегировать, образуя так называемые тельца включения. Для преодоления этого явления может быть использован рефолдинг выделенного белка.

Создание химерных белков

Низкий уровень экспрессии чужеродного белка может быть обусловлен деградацией в хозяйских клетках. Один из способов стабилизации чужеродных белков – это присоединение к какому-либо белку клетки-хозяина. Такие соединенные белки носят название химерных. Слияние белков осуществляется на уровне слияния кодирующих последовательностей. При этом важно не нарушить рамку считывания.

В зависимости от назначения белка он может быть использован в составе химерного белка (что встречается нечасто), либо требуется отщепление хозяйского белка. Один из способов – соединение белков с помощью специальной последовательности, которая распознается определенной протеазой. Это программируется на уровне нуклеотидной последовательности. Пример такого олигонуклеотидного линкера – последовательность, кодирующая полипептид Ile-Glu-Gly-Arg. После синтеза и очистки можно использовать для расщепления фактор свертывания крови Xa. Эта протеиназа специфична в отношении указанной последовательности. Поскольку такой пептид редко встречается в природных белках, его можно использовать для многих химерных рекомбинантных ферментных продуктов.

Химерные белки могут быть также использованы для упрощения процедуры очистки. Определенный полипептид в составе белка (маркерный полипептид) может использоваться для очистки с помощью иммуно-аффинной хроматографии. Для этого моноклональные антитела к маркерному полипептиду фиксируются на носителе (колонке) через которую пропускают химерный белок.

Химерные белки могут создаваться с целью повышения растворимости. Так, при соединении рекомбинантного белка с белком E.coli тиоредоксином повышает растворимость белка.

Повышение числа копий гена в плазмиде

Повышения числа копий плазмиды в клетках не всегда эффективно, т.к. чрезмерная амплификация плазмидных ДНК может нарушать рост клеточной культуры. Поэтому может использоваться встраивание нескольких копий гена в малокопийную плазмиду. Для этого конструируют набор тандемных копий гена.

Стабилизация белков путем присоединения концевых аминокислот

Присоединение определенных концевых аминокислот (присоединением кодирующего их фрагмента к гену) может повысить время жизни рекомбинантных белков от нескольких минут до нескольких часов.

Повышение эффективности секреции

Многие белки оказываются значительно стабильнее, если они секретируются в периплазму, а не остаются в цитоплазме. Такие белки также легче выделить и очистить. Обычно транспорт через мембрану обеспечивает N-концевая сигнальная последовательность. Вводя этот сигнальный пептид в белок, удается повысить эффективность секреции.

Увеличение стабильности рекДНК в клетках

Плазмидные векторы могут утрачиваться после ряда клеточных циклов и не содержащие плазмиды клетки могут получить преимущество в росте. Нестабильность плазмид является серьезной проблемой, которую необходимо решать при промышленном использовании рекомбинантных систем. Повышение стабильности может быть связано с постоянным использованием селективных питательных сред, а не только на первоначальном этапе при клонировании.

Изменение свойств ферментов генно-инженерными методами

Основным методом генно-инженерного изменении свойств ферментов является сайт-специфический мутагенез (или направленный мутагенез) – это целенаправленная нуклеотидная замена в клонированном гене, приводящая к замене одной аминокислоты на другую. Это позволяет исследовать роль определенных аминокислот в структуре фермента, а также получать ферменты с улучшенными свойствами.

Кроме аминокислотных замен в различных частях ферментов в настоящее все более развиваются генно-инженерные подходы по слиянию частей генов, кодирующих ферментов, что позволяет существенно модифицировать ферменты и даже создавать новые ферменты.

Методы сайт-специфического мутагенеза

С помощью компьютерного анализа на основании данных о структуре белка удается просчитать (предсказать) эффективную аминокислотную замену. Существует несколько методов сайт-специфического мутагенеза.

Сайт-специфический мутагенез с использованием рестрикции

Для произведения нужной аминокислотной замены из клонированного гена с использованием сайт-специфической эндонуклеазы вырезается небольшой фрагмент. Затем этот фрагмент заменяется на аналогичный искусственно-синтезированный с нужной нуклеотидной заменой, которая определит запланированную аминокислотную замену.

Этот способ не часто используется из-за сложности необходимости подбора рестриктазы, что не всегда удается.

Сайт-специфический олигонуклеотид-направленный мутагенез

В большинстве случаев сайт-специфического мутагенеза используется замена в праймере для ДНК-полимеразы. Варианты этого метода – это использование бактериофага М13 или использование ПЦР.

При использовании фага М13 интересующий ген клонируют в ДНК фага М13. Этот бактериофаг имеет одноцепочечную и двухцепочечную формы ДНК. Одноцепочечную форму этого фага копируют с использованием олигонуклеотидного праймера синтезированного таким образом, чтобы в гене-мишени была замена одного нуклеотида. Олигонуклеотид в точности комплементарен последовательности за исключением одного нуклеотида в нужном сайте. Неспаренный нуклеотид обычно должен находиться примерно посередине олигонуклеотида. 3'-конец нуклеотида служит затравкой для синтеза ДНК. Затем двухцепочечными ДНК М13 трансформируют клетки E.coli. В клетках фаг реплицируются и одна часть рекомбинантных фаговых частиц будут содержать необходимую замену, другая часть останется дикого типа.

Сходным образом олигонуклеотид-направленный мутагенез может осуществляться с помощью плазмидной ДНК.

Сайт-специфическое изменение свойств ферментов генно-инженерными методами

Сайт-специфический мутагенез можно использовать как для придания новых свойств уже существующим белкам, так и для создания уникальных ферментов. Выбор аминокислоты, подлежащей замене, как правило, производится с учетом ее роли в функционировании белка. Данные об этом получают в ходе ренгеноструктурного анализа трехмерной структуры белка.

Повышение термостабильности путем образования дополнительных дисульфидных связей

Образование в белковой молекуле дополнительных дисульфидных связей может способствовать значительному повышению термостабильности белковой молекулы. Необходимо, чтобы новые связи не мешали нормальному функционированию белка. В одном из экспериментов при помощи олигонуклеотид-направленного мутагенеза были созданы шесть вариантов лизоцима фага Т4 с новыми внутрицепочечными дисульфидными связями. Для этого два, четыре или шесть специфических аминокислотных остатков полипептидной цепи были заменены на остатки цистеина, в результате чего образовалась одна, две и три дисульфидных связи соответственно. Были использовано несколько вариантов положений аминокислотных остатков. Аминокислотные остатки, замененные на остатки цистеина, располагались близко друг к другу, так что при образовании новых дисульфидных связей общая конформация молекулы существенно не изменялась. Кроме того, они находились вне активного центра фермента.

После мутагенеза мутантные гены клонировали в клетках E.coli, рекомбинантные белки очищали и определяли их ферментативную активность и термостабильность. Последняя обычно характеризуется температурой, при которой молекула денатурирует на 50% (степень денатурации определяется по изменению кругового дихроизма в растворе белка). Исходная (нативная) форма лизоцима Т4 содержит два свободных остатка цистеина, не участвующих в образовании дисульфидных связей. У фермента «псевдодикого типа» они заменены на остатки Thr и Ala, при этом активность и термолабильность остались прежними.

Результаты этого эксперимента показали, что термостабильность фермента повышается при образовании новых дисульфидных связей, при этом наиболее термостабильным является белок с максимальным числом таких связей. Однако некоторые варианты, будучи более термостабильными, чем нативный фермент или фермент «псевдодикого типа», не обладают ферментативной активностью. Возможно, это обусловливается искажением конформации белковой молекулы при образовании определенных дисульфидных связей.

Хотя создание ферментов с новыми свойствами методами генной инженерии часто представляет собой эмпирический процесс, описанный эксперимент показывает, что этот подход дает вполне реальные результаты.

Замена аспарагина на другие аминокислоты

При высоких температурах остатки аспарагина и глутамина могут дезаминироваться с образованием аммиака. При этом они превращаются в аспарагиновую и глутаминовую кислоты соответственно, что приводит к нарушениям конформации полипептидной цепи и снижению или утрате активности фермента. Эксперименты по замене таких аминокислотных остатков демонстрируют повышение термостабильности фермента.

Уменьшение числа свободных сульфгидрильных групп

Некоторые чужеродные белки, синтезируемые рекомбинантными системами, оказываются менее активными из-за образования димеров и более высокомолекулярных неактивных комплексов. Эксперименты показывают, что замены одного или нескольких цистеиновых кодонов на, например, сериновые приводит к синтезу белка, не образующего мультимерных комплексов.

Повышение ферментативной активности

С помощью сайт-специфического мутагенеза можно не только повысить стабильность ферментов, но и изменить их каталитическую активность. Для этого необходимо располагать детальной информации о геометрии его активного центра. В этом случае можно предсказать, какие замены необходимо произвести для изменения специфичности фермента к субстрату.

Возможности такого подхода иллюстрируют результаты эксперимента по изменению специфичности связывания субстрата тирозил-тРНК-синтетазой. Этот фермент на первом этапе активирует тирозин связыванием с АТР, на втором этапе тирозиладенилат присоединяется к тРНК с высвобождением АМР. С использованием компьютерного моделирования были предсказаны замены, которые могут повлиять на субстратную специфичность. Чтобы проверить правильность прогнозов, с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза в ген тирозил-тРНК-синтетазы были внесены специфические мутации. Остаток треонина в положении 51 был заменен на остаток аланина или пролина. Чтобы охарактеризовать получившиеся ферменты, определили их каталитические константы. В некоторых случаях изменения оказались даже значительнее, чем ожидалось. Так, для Ala-51-фермента константа связывания (К_М) с АТР уменьшилась примерно в два раза без значительного изменения каталитической константы, а для фермента с Pro-51 – более чем в 100 раз.

Таким образом, сродство ферментов к субстрату и каталитическую активность ферментов можно повысить, внося соответствующие изменения в клонированный ген.

Изменение потребности ферментов в кофакторах

Изменение потребности фермента в кофакторе продемонстрировано на примере модификации субтилизина. Субтилизины – сериновые протеиназы, которые секретируются грамположительными бактериями и используются в качестве биодеградируемого детергента. Все субтилизины прочно связывают один или несколько атомов кальция, повышающих их стабильность. Субтилизины используются в таких промышленных процессах, где участвуют в больших количествах соединения, хелатирующие металлы, в том числе кальций и в таких условиях субтилизины быстро теряют свою активность. С использованием рентгеноструктурных данных о структуре белка, был получен модифицированный продукт с небольшой делецией в области, отвечающей за связывание кальция. Мутантный белок сохранял конформацию. Затем было внесено несколько аминокислотных замен, предположительно повышающих стабильность фермента. Значение двух стабилизирующих мутаций подтвердилось. В результате был получен мутантный субтилизин, обладающий кинетическими свойствами, сходными с таковыми исходного субтилизина. Кроме того, новый субтилизин в отсутствие кальция был почти вдвое более стабилен, чем исходный фермент даже в присутствии кальция.

Полученные эксперименты показывают что, несмотря на трудоемкость этих экспериментов, с помощью методов генной инженерии можно эффективно изменять свойства ферментов.

Изменение специфичности фермента

Сайт-специфический мутагенез используют в основном для улучшения уже существующих свойств ферментов, более редкие эксперименты касаются изменения специфичности ферментов. Например, удается на основе одной сайт-специфической эндонуклеазы получить фермент с иной специфичностью. Несмотря на большое число известных рестриктаз, крупнощепящих ферментов (узнающих 8-нуклеотидные сайты и расщепляющие ДНК на большие фрагменты) не так уж много. Поиск новых рестриктаз – достаточно непростая задача, поэтому для получения рестриктаз с необходимой специфичностью предложены альтернативные генно-инженерные подходы.

В работах по созданию новых рестриктаз использована малоспецифичная рестриктаза FokI и «цинковые пальцы» ‒ фрагмент белковой молекулы, связывающие ионы Zn²⁺ и присоединяющиеся к определенным последовательностям ДНК. Химерный белок включал эти компоненты в своем составе плюс линкерный участок для придания гибкости молекуле. В результате удалось получить рестриктазы с необходимой специфичностью.