6.5.4 Ферменты

Ферменты (от лат. fermentum - брожение, закваска), специфи- ческие белки, присутствующие во всех живых клетках и играющие роль биологических катализаторов.

Ферменты являются регуляторами скорости химических реакций, строго контролируют процессы синтеза и распада индивидуальных химических компонентов клетки и всего организма в целом. Благодаря этому свойству ферментов живые системы сохраняют постоянство внутренней среды (так называемый гомеостаз). Ферменты выполняют важные защитные функции, обезвреживая как экзогенные (поступаю- щие из внешней среды), так и эндогенные (образующиеся в самом ор- ганизме) токсические вещества. Последние подвергаются под действи- ем ферментов различным реакциям окисления, восстановления и, нако- нец, распада на продукты, теряющие свои токсические свойства.

Методы выделения и очистки ферментов. Хотя уже осуще- ствлен лабораторный синтез ряда ферментов - рибонуклеазы, лизоци- ма, ферредоксина и цитохрома - С, трудно ожидать, что синтетическое получение ферментов получит широкое распространение в ближайшие десятилетия ввиду его сложности и дороговизны, поэтому единствен- ный реальный в настоящее время способ получения ферментов - это выделение их из биологических объектов.

Выделяют ферменты так же, как и другие белки, хотя есть прие- мы, применяемые преимущественно для ферментов. Из них можно от- метить экстракцию глицерином, в котором сохраняются нативные свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше -10°С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. К их числу отно-

106

сится также получение ферментов путем адсорбции с последующей элюцией (снятием) с адсорбента. Наряду с ними широко применяют метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит, элек- трофорез и особенно изоэлектрофокусирование. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка, так как она всегда связана с поте- рей ферментативной активности. Этому способствует проведение опе- раций в присутствии защитных добавок, в частности HS-содержащих соединений (цистеина, глутатиона, меркаптоэтанола, цистеамина, ди- тиотреитола и др.).

Переломным моментом в усовершенствовании методов полу- чения высокоочищенных, гомогенных препаратов ферментов было от- крытие способности их кристаллизоваться, осуществленное впервые в

1906 г. А. Д. Розенфельдом (им была получена в виде кристаллов ок- сидаза из корней редьки) и приобретшее с 1926 г. широкую из- вестность после работы Д. Самнера по получению кристаллической

уреазы из бобов канавалии.

Медицинская энзимология. Существуют три основных направ- ления исследований в области медицинской энзимологии: энзимопато- логия, энзимодиагностика и энзимотерапия.

Энзимопатология призвана изучать молекулярные основы раз- вития патологического процесса, основанные на данных нарушениях механизмов регуляции активности или синтеза индивидуального фер- мента, или группы ферментов. Так как, чаще всего, развитие болезни непосредственно связано с наследственной недостаточностью или пол- ным отсутствием синтеза одного единственного фермента в организме больного.

Так, например, развитие тяжелого наследственного заболевания – галактоземии (непереносимость молочного сахара) связано с отсутст- вием синтеза в клетках печени фермента, катализирующего превраще- ние галактозы в глюкозу.

Энзимодиагностика призвана заниматься разработкой фер-

ментных тестов, основанных на определении активности (уровня) фер- ментов и изоферментов в биологических жидкостях организма больно- го (сыворотка крови, желудочный сок, спинномозговая жидкость, моча

и др.).

В настоящее время разработаны количественные методы анализа многих распространенных ферментов, выявляемых в биологических жидкостях при поражении разных органов. Для каждого из этих фер-

107

ментов определены контрольные величины (уровни) активности и пре-

делы колебания в норме как в сыворотке крови, так и в самом органе.

Диагностическая энзимология достигла значительных успехов при постановке диагноза болезней многих органов, в частности почек, сердца, поджелудочной железы, желудка, кишечника и легких. Фер-

ментная диагностика может служить основой не только для постанов-

ки правильного и, что самое главное, своевременного диагноза болез-

ни, но и для проверки эффективности применяемого метода лечения.

Обладая высокой специфичностью действия, ферменты приме- няются в качестве самых тонких и избирательных инструментов в на- правленном воздействии на течение любой патологии. О степени по-

ражения органов, биомембран клеток и субклеточных структур, о тя-

жести патологического процесса можно судить по появлению (или рез- кому повышению уровня) органотропных ферментов и изоферментов в сыворотке крови больных, что составляет предмет диагностической эн- зимологии.

Энзимотерапия. Ферменты используются для лечения различ- ных заболеваний, в том числе и наследственных, вызванных наруше- нием синтеза того или иного фермента или резким перепадом субстра-

та, на который организм не смог среагировать по причине, например,

ослабленного иммунитета. Также ферменты применяют для лучшего вживания и устойчивости в организме искусственных органов, проте- зов, их применяют в различных перевязочных материалах для ускоре- ния заживления ран и ожогов, для разрушения тромбов.

Основной проблемой при использовании ферментов является их быстрая инактивация, аллергенность, токсичность (так как по существу они чужеродны для данного организма), доставка точно в пораженный орган или ткань. Для решения этих проблем применяют методы иммо- билизации ферментов, разработанные инженерной энзимологии. Иммобилизация ферментов заключается в их физическом (адсорбци- онном) и (или) химическом (ковалентном) связывании с некой матри- цей носителя, который защищает фермент от инактивирующего воз- действия и не влияет на его активные центры.

Основные требования к иммобилизованным ферментам:

- иммобилизованные ферменты должны сохранять свою актив-

ность в течение максимально возможного времени;

- введенные в организм вещества должны быть мало подвержены действию антител и естественных ингибиторов;

- не должны оказывать негативного воздействия на организм в це-

лом;

108

- носитель, с которым связан фермент, должен обеспечивать не только устойчивость, но и направленную доставку исключительно или хотя бы предпочтительно в зону поражения.

Таким образом, если присутствие данного фермента необходимо во всех органах и тканях организма или он необходим для длительной циркуляции в кровотоке, то целесообразно применять растворимые препараты, то есть связывать фермент с неким растворимым носителем

(растворимые капсулы, или «искусственные клетки»). В некоторых случаях идут по пути создания биоразлагаемых и биосовместимых производных ферментов в виде микрочастиц, гранул или таблеток, ко- торые способны «добираться» к местам поражения и в течение опреде- ленного времени диффундировать необходимый фермент. Для наруж- ного применения соответствующий фермент иммобилизуют на по- верхности или в объеме перевязочных материалов, защитных пленок, дренажа или добавляют содержащие его микрокапсулы в различные мази и кремы.