1. Фітонциди і фітоалексини

Фітонциди, за визначенням Б.П.Токіна (1966), – це «бактерицидні, фунгіцидні, протистоцидні речовини, які продукуються рослинами, і які є одним з факторів їх імунітету та які відіграють роль у взаєминах організмів у біоценозах». Фітонцидною активністю рослин були пояснені багато давно відомих фактів взаємного впливу рослин одна на одна – пригнічення життєдіяльності одних і стимулювання інших. Експериментально показано, що летучі фітонциди житняка і вівса стимулюють проростання пилкових зерен люцерни, а летучі фітонциди тимофіївки, навпаки, пригнічують.

Спочатку передбачалося, що фітонциди є летучими речовинами, виділюваними рослинами за поранення. Надалі, однак, стало очевидно, що нетравмовані рослини також виділяють фітонциди, якими можуть бути як летучі, так і нелетучі сполуки. Відкриття фітонцидів відноситься до числа великих досягнень вітчизняної біології. Зараз уже не підлягає сумніву, що фітонцидну активність мають усі рослини без винятку.

Роль фітонцидів у явищах імунітету рослин протягом ряду років вивчається Д.Д.Вердеревським, який дійшов висновку, що ведуче значення у захисті живого тіла рослин як від збудників паразитарних хвороб, так і від комплексу сапрофітних гнильних мікробів мають їх фітонцидні особливості. Однак на шляху експериментального обґрунтування цього дуже важливого висновку є серйозні методичні труднощі, тому що хімічна природа фітонцидів усе ще недостатньо вивчена. Результати досліджень, присвячених хімії фітонцидів, показали, що фітонциди є комплексом глікозидів, дубильних речовин, альдегідів та інших сполук (Токін, 1966).

Показано, що фітонцидна активність зараженої рослинної тканини вище, ніж інтактної, причому для стійких сортів рослин ці розходження виявилися набагато більшими, ніж для сприйнятливих (Вердеревський і ін., 1964). Досліди проводилися з багатьма рослинами і різними збудниками хвороб. Так, у стійких сортах кукурудзи, уражених пухирчастою сажкою, а також винограду, інфікованого мільдью, фітонцидна активність зростала майже вдвічі і тривалий час утримувалася на цьому рівні. У сприйнятливих сортів первісне зростання активності потім змінювалося різким її пригніченням. За зараження томатів вірусом тютюнової мозаїки виявлена кореляція між репродукцією вірусу та антивірусною активністю тканин. Важливе значення цих досліджень складається насамперед у тім, що ними переконливо показана тісна залежність між стійкістю рослин і їхній фітонцидною активністю, обумовленою присутністю антибіотичних речовин. Виникає, однак, ряд питань і, зокрема, про причини зростання фітонцидної активності рослин у відповідь на зараження: чи обумовлено воно збільшенням вмісту фітонцидів, що були присутніми у тканинах ще до контакту з паразитом, або утворенням нових антибіотичних речовин, що виникають у відповідь на контакт із паразитом.

Велике число робіт присвячене вивченню антибіотичних речовин, що виникають у рослинних тканинах у відповідь на ураження і названих фітоалексинами. За порівняно короткий термін були ізольовані і хімічно ідентифіковані декілька фітоалексинів. Це дало підставу Круикчанку (Cruickshank, 1963) – одному з ведучих дослідників фітоалексинів, – заявити, що нині вже немає необхідності пояснювати природу стійкості рослин наявністю якоїсь гіпотетичної і ще поки неідентифікованої речовини. Значення виконаних досліджень важко переоцінити. Теорія фітоалексинів виникла в 1940 р. на основі дослідів із зараження бульб картоплі вірулентною й авірулентною расами Ph. infestans. Автори цих досліджень Мюллер і Боргер (Muller, Borger, 1940) свої висновки сформулювали у вигляді наступних положень.

1. Фітоалексини можна охарактеризувати як властивий рослині фактор, що утвориться заново або утворення якого активується після того, як клітки рослини приходять у зіткнення з паразитом. Фітоалексини утворюються в ході некротичної реакції і служать причиною загибелі паразита.

2. Фітоалексини можуть виникати тільки в живих клітинах рослини.

3. Фітоалексини – це хімічні речовини, що є продуктами некрозу клітин рослини-хазяїна.

4. Фітоалексини неспецифічні у відношенні різних грибів, але різні гриби чутливі до них не однаковою мірою.

5. Стійкі і сприйнятливі рослини реагують на зараження якісно однаково, усе розходження між ними полягає у швидкості утворення фітоалексинів.

6. Захисна реакція зосереджена в тканинах, де знаходиться паразит, і в тканині, безпосередньо прилеглій до місця зараження.

7. Швидкість утворення фітоалексинів, властива даній рослині, визначається його генотипом.

Ці сім положень, що складають основу сучасної теорії фітоалексинів, були сформульовані ще тоді, коли про існування цих сполук тільки підозрювали, оскільки жоден з них не був ізольований і хімічно ідентифікований. Останнім часом отримано багато нових даних, що стосується виділення, ідентифікації і характеристики фітоалексинів ряду рослин.

Дотепер присутність антигрибних речовин виявлено при зараженні батата, орхідеї, ячменя, моркви, картоплі, турнепсу, квасолі, зеленого перцю, соєвих бобів, рису та інших рослин. З їхнього числа ізольовані і хімічно ідентифіковані: іпомеамарон, пізатин, орхінол, ізокумарин, трифоліризин і фазеолін (рис.1).

Першим у 1943 р. був ізольований іпомеамарон (Hiura, 1943), що виникає за ураження батата Ceratostomella Jimbriata. Він був ідентифікований як 2-метил-2-(4-метил-2-оксипентил)-5(3-фурил)-тетрагідрофуран (Kubota, Matsurua, 1953).

Орхінол утворюється за взаємодії Rhizoctonia repens з бульбами Orchis militaris і являє собою 9,10-дигидро-2,4-диметокси-6-гідроксифенантрен (Schellenbaum, 1959).

Під час взаємодії коренів моркви з Ceratocystis fimbriata, що не є паразитом моркви, був ізольований ізокумарин. Ця сполука являє собою 3-метил-6-метокси-8-гидрокси-3,4-дигідроксиізокумарин (Sondheimer, 1961; Condori, Киснув, 1960; Condon, Kuc, Draudt, 1963).

Приблизно в цей же час був ізольований пізатин (Cruickshank, Perrin, 1960, 1961), що утвориться у відповідь на інокуляцію ендокарпу бобів гороху Manilla fructicola і являє собою 3-гидрокси-7-метокси-4,5-метилендиоксихроманокумараном (Perrin, Bottomley, 1962).

З коренів червоної конюшини був виділений глікозид трифоліризин (Hietala, 1960), аглікон якого за своєю структурі дивно нагадує пізатин. Нещодавно із квасолі у відповідь на інокуляцію М. fructicola була виділена ще одна сполука, названа фазеоліном (Cruickshank, Perrin, 1963). Подібно пізатину воно виявилося 7-гидрокси-3'4'-диметилхроменохроманокумарином.

Утворення фітоалексинів у тієї самої рослини викликали самі різноманітні гриби, серед яких були факультативні й облігатні паразити, патогени, які специфічно паразитують на цій рослині, і фітопатогенні гриби, що не уражають даний вид рослини. Наприклад, Круикчанк і Перрин (Cruickshank, Perrin, 1962) склали цілі таблиці іспиту здатності різних грибів індукувати утворення пізатину, серед яких були як патогени, так і непатогени гороху. Якої-небудь закономірності в кількостях пізатину, утвореного горохом у відповідь на інокуляцію патогенами і непатогенами, знайти не удалося.

Проте не слід вважати, що усі без винятку гриби викликають утворення фітоалексинів. Наприклад, орхінол не утворювався в тому випадку, якщо для зараження орхідних використовувалися звичайні сапрофітні і напівпаразитні ґрунтові гриби (Gaumann, Kern, 1959). З іншого боку, паразит моркви Stemphylium radicinum не викликав у ній утворення ізокумарину (Condon, Kuc, 1960).

Для характеристики чутливості паразитів до фітоалексинів уведена величина ЕД₅₀, тобто ефективна доза, або та концентрація фітоалексину, яка пригнічує ріст міцелію паразита на 50%. Величина цієї дози розраховується за кривою, на абсцисі якої відкладається концентрація фітоалексину, а на ординаті – ріст міцелію гриба. Та концентрація фітоалексину, що пригнічує ріст міцелію наполовину, і є величина його ЕД₅₀. Для кожного паразита по відношенню певного фітоалексину своя величина ЕД₅₀.

Згідно даним Круикчанка (Cruickshank, 1961) усі випробувані гриби чітко розділилися на 2 класи: чутливі до пізатину і відносно нечутливі до нього. Перша група грибів представлена 44 паразитами інших рослин, але не гороху. Величина ЕД₅₀ для 38 з них була менше, ніж 50 мкг/мл. У другу групу ввійшли 6 відомих паразитів гороху, величина ЕД₅₀ Для яких вище, ніж 100 мкг/мл (виключення представляє Septoria pisi, ЕД₅₀ якої коливається між 75-100 мкг/мл). У цій же роботі наводяться дані по пригніченню росту кожного гриба концентрацією пізатину 100 мкг/мл. За такої концентрації ріст 5 паразитів гороху з 6 випробуваних пригнічується менше, ніж на 50%, у той час як 37 непатогенів гороху інгібуються нею майже на 90%. Якщо зіставити концентрацію фітоалексину, виявленого в дифузіатах у відповідь на інокуляцію грибом, з чутливістю грибів до даного фітоалексину, визначеної в дослідах In vitro, то виявиться, що непатогени гороху викликають утворення фітоалексинів у концентраціях, що перевищують величину їх ЕД₅₀, а кількість фітоалексину, яка утворюється у відповідь на інокуляцію патогенами, значно менше значень їх ЕД₅₀. Іншими словами, кількості фітоалексину, що утвориться в диффузіатах у відповідь на інокуляцію патогенами, недостатня для того, щоб придушити їх розвиток. Цей висновок здавався беззмістовним, оскільки він означав, що фітоалексини відіграють захисну роль тільки в явищах неспецифічного фітоімунітету, тобто за несумісних комбінацій хазяїн – паразит. Таким чином, здавалося, що саме фітоалексини відповідальні за явища неспецифічного імунітету, концепцію якого так добре виразив Честер (Chester, 1933), сказавши, що більшість існуючих рослин стійкі до більшості наявних грибів.

Однак, якщо у насінні камери бобів приміщали краплі, які містять спори патогену гороху, то інфекційні гіфи, що утворюються після проростання таких спор, швидко проникають у тканині ендокарпу. Таким чином, фактором, що визначає стійкість при зараженні патогеном, є концентрація пізатина в тканинах ендокарпу гороху. Облік у тканині ендокарпу показав, що відносно стійкі сорти утворювали в 2-4 рази більшу кількість пізатину, чим сорти високо сприйнятливі. При дослідженні пізатину, який утвориться у відповідь на інокуляцію того самого сорту гороху штамами A. pisi, що розрізняються за ступенем вірулентності, виявилося, що рослина утворює пізатин у значно більших кількостях під час зараження невірулентним штамом, ніж під час інфекції вірулентним штамом того ж паразита. Тобто. активність фітоалексинів визначається за ступенем пригничення росту міцелію гриба, а не проростання його спор. Справа в тім, що утворення фітоалексинів починається тільки через деякий час після проростання спор в інфекційній краплі, точніше у відповідь на ті метаболіти, що утворюються під час їх проростання. Таким чином, дія фітоалексинів спрямована не на проростання спор, а на ріст гіф патогену. Як і слід було очікувати, ріст гіф виявився значно більш чутливим до фітоалексинів, ніж проростання спор.

Утворення фітоалексинів можуть викликати не тільки самі пророслі спори, але також екстракт, який утворюється в результаті їх росту. Таким чином, для індукування фітоалексинів зовсім необов'язкове проникнення паразита в клітину. Для цього достатній просто фізіологічний контакт метаболічних систем хазяїна і паразита. Що стосується безпосереднього індуктора утворення фітоалексинів, то з цього приводу поки нічого не відомо. Можна тільки припускати, що індуктором є речовина типу ферменту або гормону.

Індукувати утворення пізатйну можуть багато амінокислот, зокрема L-валін, D,L-норлейцин, D,L-норвалін, а також деякі важкі метали. Звідси випливає принципово нова можливість добору та іспиту фунгіцидів. Оскільки велика частина фунгіцидів є сполуками, до складу яких входять важкі метали, особливо ртуть і мідь, то обробка ними рослини повинна сприяти утворенню останніми фітоалексинів. Таким чином, дія фунгіцидів зараз представляється двоякою: з одного боку, вони діють безпосередньо на збудника хвороби, а з іншого, незалежно від цього, підвищують стійкість рослини проти збудника інфекції (Chruickshank, 1965).

Структуру фітоалексину, який утворюється, визначає генотип рослини, але ніяк не генотип паразита. Генотип паразита може лише визначати той або інший ступінь чутливості до даного фітоалексину. Рослина виявиться стійкою тільки в тому випадку, якщо вона утворить фітоалексин у концентрації, достатній для того щоб придушити розвиток паразита, і сприйнятливою, якщо концентрація фітоалексину недостатня для пригнічення патогену.

Фітоалексини пригнічують розвиток мікроорганізмів у середньому в концентраціях порядку 100 мкг/мл. Якщо врахувати, що антибіотики типу пеніциліну і стрептоміцину цілком пригнічують ріст багатьох стрептококів і стафілококів у значно більш низьких концентраціях, то фітоалексини варто віднести до слабких антибіотиків.

Але і стосовно фітопатогенних грибів стійкість рослин далеко не завжди пов'язана з утворенням фітоалексинів. Як відзначають самі автори фітоалексинної теорії, роль фітоалексинів виявляється лише в тих випадках, коли стійкість рослин заснована на некротичній реакції. Правда, некротична реакція широко поширена в рослинному світі, але не тільки вона визначає стійкість рослин до паразитарних грибів.

Результати численних експериментальних досліджень приводять до висновку, що всі антибіотичні речовини рослин з погляду їхньої захисної ролі в явищах фітоімунітету можна розділити на 2 основні групи.

Перша група являє собою антибіотичні речовини, які містяться у рослині ще до контакту з паразитом. Відомо, що здорові тканини багатьох рослин служать сировиною для одержання антибіотиків. Ці речовини утримуються в рослинах у концентраціях, достатніх для пригнічення росту багатьох мікроорганізмів. Вони є продуктами нормального обміну рослинної тканини і тому можуть бути названі конституційними інгібіторами. Вміст цих інгібіторів може зростати в процесі зараження, як втім і вміст інших конституційних речовин клітини.

Друга група являє собою антибіотичні речовини, що виникають у рослинах після контакту з паразитом. Правда, в окремих випадках деякі з цих речовин виявлені і в здорових рослинах, але в настільки малих кількостях, що не можуть чинити антибіотичної дії. Лише у відповідь на інфекцію речовини цієї групи досягають значних концентрацій, здатних придушити ріст гриба. Такого роду речовини, як правило, є результатом зміненого обміну, на який переключається метаболізм рослини-хазяїна у відповідь на втручання паразита. Тому антибіотичні речовини другої групи можна назвати індукованими (Метлицький, Ахвледіані, 1965).

Подібна класифікація антибіотичних речовин якоюсь мірою умовна, оскільки антибіотичні речовини, які містяться в здорових і уражених тканинах, генетично між собою пов'язані.