20. Биосинтез днк. Повреждение и репарация днк.

Репликация ДНК – это процесс, при котором информация, закодированная последовательностью нуклеотидов, родительской ДНК с абсолютной точностью передается дочерней ДНК; процесс идет в направлении 5’-3’ в S-фазу клетки. Источником энергии служит нуклеозидтрифосфаты с дезоксирибозой. Отщепляется пирофосфорная кислота, которая разлагаясь пирофосфатазой дает дополнительную энергию.

Репликация ДНК проходит по полуконсервативному механизму, при этом одна материнская нить дает новую дочернюю нить. Этапы репликации: 1) инициация. 2) элонгация. 3) терминация. Инициация – происходит образование репликативной вилки, формирование праймосомы, синтез праймера. Топоизомераза I и инициирующий белок DnаА обнаруживают места начала репликации по ориджинам (определенная последовательность нуклеотидов).Топоизомераза I и II (ДНКгераза у прокариот) снимают суперспирализацию. Репликативная вилка – это та часть молекулы ДНК, которая уже расплелась в данный момент и служит матрицей для синтеза дочерней ДНК. Репликативная вилка перемещается вдоль молекулы ДНК (у эукариот много РВ, это ускоряет этот процесс). В репликативной вилке на одной нити ДНК формируется праймосома – комплекс из 20 полипептидов (хеликаза, SSB белки, праймаза и др.). n’-белок передвигает праймосому по нити ДНК, используя энергию АТФ. Хеликазы Rep и DnaB – движутся в оду сторону, разрывая водородные связи, гидролизуя АТФ. SSB-белки распрямляют нити ДНК и не дают им снова переплестись и образовать петли. Праймаза (РНК_ДНК-полимераза) – синтезирует праймер – это РНК-затравка. На нити 3’-5’ праймер образуется только один раз – на лидирующей цепочке, на нити 5’-3’ он образуется многократно (на 3’-конце будет свободная ОН-группа). Роль праймера: 1) ДНК-полимераза нечуствительна к репликативной вилке, а праймаза чувствительна. 2) Для активации ДНК-полимеразы необходима затравка со свободной 3’ОН-группой, которую и предоставляет праймер. 3) Удаление праймера служит сигналом для проверки правильности включения нуклеотидов в дочернюю цепь ДНК-полимеразы. Элонгация – осуществляется синтез дочерней ДНК. Основной фермент ДНКполимеразаIII, который присоединяет нуклеозидтрифосфаты с дерибозой к 3’ОН-группе, при этом выделяется пирофосфорная кислота, которая пирофосфатазой расщепляется на две молекулы фосфорной кислоты, что делает процесс необратимым. Отборка нуклеотидов осуществляется по правилу комплиментарности, присоединяя нуклеотиды проявляет 5’-3’ полимеразную активность. Если нуклеотид присоединен неправильно, то фермент делает шаг назад в направлении 3’-5’ и вырезает его, т.е. проявляет экзонуклеазную активность. Т.О. репликация осуществляется ДНК-полимеразой III – основной фермент синтеза на нити 5’-3’ (запаздывающая цепь) – фрагменты Оказаки – каждый фрагмент включает в себя праймер и участок вновь синтезированной ДНК. ДНК-полимераза III осуществляет синтез до конца предыдущего праймера, она не способна удалить праймер, ее сменяет ДНК-полимераза I, которая обладает теми же свойствами что и ДНК-полимераза III, но еще также способна в направлении 5’-3’ проявлять экзонуклеарную активность, т.е. вырезать праймер – вырезает нуклеотид с рибозой, а с дезоксирибозой. ДНК-лигаза сшивает короткие разрывы. ДНК-полимераза III работает в 60 раз быстрее чем ДНК-полимераза I. ДНК-полимераза II принимает участие в процессах репарации. Все виды ДНК-полимераз I II III встречаются у бактерий, у эукариот они обозначаются буквами греческого алфавита: ДНК-полимераза альфа – отвечает за синтез запаздывающей цепи фрагментами Оказаки, т.к. одна из субъединиц обладает праймазной активностью. ДНК-полимераза бета – участвует в процессе репарации ДНК и удаляет праймер. ДНК-полимераза гамма – синтез мДНК. ДНК-полимераза Б – синтез лидирующей цепи ДНК. ДНК-полимераза ипсилон – работает или с альфа, или с Б ДНК-полимеразой, участвует в репарации, заменяет участок на новый.

В процессе элонгации переписывается вся ДНК (экзоны и интроны), отделяются праймеры. Процесс заканчивается формированием дочерней цепи ДНК. Терминация наступает когда встречаются репликативные вилки и исчерпана ДНК матрицы. Клетка выходит из S-фазы и активность ферментов падает и остается на низком уровне до следующей репликации. Реплицированный хроматин метится с помощью метилаз (метилирование). Значение метилирования: 1) защита собственной ДНК от воздействия рестиктаз. 2)Метилированные участки служат для узнавания специфическими регуляторными белками – горячими точками мутогенеза: метилированный Ц – NH₃  Т.

Типы повреждения ДНК:1) повреждение затрагивающее отдельные нуклеотиды: А) апуринизация – потеря азотистого основания, т.е. остается остов с дезоксирибозой без азотистого основания. Исправляет это ДНК-инсертаза, она включает азотистые основания по принципу комплиментарности. Б) спонтанное дезаминирование: аденин – NH₃ в присутствии воды  гипосантин. Цитозин  урацил. Гуанин  сантин. В) делеция (вставка) нуклеотидов. Г) включение основания аналога. Д) алкинирование азотистого основания. 2) Повреждение затрагивает пары нуклеотидов, что приводит к образованию пиримидиновых димеров (сшивок). 3)Разрывы цепей под действием ионизирующей радиации.

Механизм фотореактивации под влиянием видимого света происходит активация фермента фотолиазы, которая действует на тиминовые димеры, связь между ними разрушается и образуется тимин. Эксцизионная репарация – осуществляется комплексом ферментов. В одну из двух нитей встроено не то азотистое основание, его обнаруживает фермент N-гликозилаза. Эндонуклеаза делает разрез, а экзонуклеаза вырезает десятки нуклеотидов. ДНК-полимераза I ресинтезирует участок разрушенной ДНК в направлении 5’-3’, подбирая правильные нуклеотиды по правилу комплиментарности. ДНК-лигаза сшивает оставшийся разрыв.

Процессы репарации: 1) пигментная ксеродерма – нарушена световая репарация, поэтому у людей повышена чувствительность к ультрафиолету, что приводит к раку кожи и к летальному исходу. 2) анемия Данкони (Фанкони) – наблюдается снижение образования всех форменных элементов крови  неустойчивые лейкоциты, гемолиз эритроцитов, трансформация скелета. Нарушена репарация повреждений от химических мутогенов. 3) Атаксия или ангиэктазия – повышенная чувствительность к гаммаизлучению, нет фермента гаммаэндонуклеазы, развиваются кожные пятна и мозжечковые расстройства. 4) прогерия – ребенок рождается как старичок, его кожа быстро стареет и сморщивается. Все случаи сопровождаются развитием опухолей.