21. Транскрипция, генетический код, процессинг рнк.

Биосинтез РНК – транскрипция – процесс считывания генетической информации с ДНК, при котором нуклеотидная последовательность ДНК кодируется в виде нуклеотидной последовательности РНК. Используется в качестве энергии и субстрата – нуклеозид-3-фосфат с рибозой. В основе лежит принцип комплиментарности – консервативный процесс – синтезируется новая одноцепочная РНК во время всей интерфазы, начинается в определенных участках – промоторах, заканчивается в терминаторах, а участок между ними – оперон (транскриптон) – содержит один или несколько функционально связанных генов, иногда содержит гены которые не кодируют белки. Отличия транскрипции: 1) транскрибируются отдельные гены. 2) не требуется праймера. 3) в РНК включается рибоза, а не дезоксирибоза.

Этапы транскрипции: 1) связывание РНК-полимеразы с ДНК. 2) инициация – образование цепи РНК. 3) элонгация или рост цепи РНК. 4) терминация.

1 этап – участок с которым связывается РНК-полимераза называется промотор (40 нуклеотидных пар) – имеет сайт узнавания, прикрепления, инициации. РНК-полимераза узнав промотора садится на него и образуется закрытый промоторный комплекс, в котором ДНК спирализовано и комплекс может легко диссоциировать и переходить в открытый промоторный комплекс – связи прочные, азотистое основание выворачивается наружу.

2 этап – инициация синтеза РНК заключается в образовании нескольких звеньев в цепи РНК, синтез начинается на одной цепи ДНК 3’-5’ и идет в направлении 5’-3’. Стадия заканчивается отделением б-субъединицы.

3 этап – элонгация – удлинение цепочки РНК – происходит за счет Core-рРНК-полимеразы. Нить ДНК деспирализована на 18ти парах, а на 12 – гибрид – общий гибрид ДНК и РНК. РНК-полимераза продвигается по цепочке ДНК, а после восстановление цепочки ДНК. У эукариот когда РНК достигает 30 нуклеотидов на 5’-конце образуется защитная структура КЭП.

4 стадия – терминация – происходит на терминаторах. В цепочке находится участок богатый ГЦ, а затем от 4 до 8 расположенных подряд А. После прохождения участка в РНК продукте образуется шпилька и фермент дальше не идет, синтез прекращается. Важную роль играет белковый фактор терминации – ро и тауэр. Пока шел синтез пирофосфат ингибировал ро белок, т.к. фермент остановился (шпилька) прекратился синтез фосфорной кислоты. Ро белок активируется и проявляет нуклеозидфосфатазную активность, что приводит к высвобождению РНК, РНК-полимеразы, которая в дальнейшем объединяется с субчастицей.

Процессинг – созревание РНК. Включает в себя: 1) образование КЭП на 5’-конце, участвует в присоединение к рибосоме. 2) на 3’-конце происходит полиаденилирование и образуется хвост из ста-двухсот адениловых нуклеотидов, он защищает ‘-конец от действия нуклеаз и помогает проходить через ядерные поры и играет роль в присоединение к рибосоме. 3) сплайсинг – вырезается не кодирующие последовательности – интроны. Это происходит двумя путями: а) осуществляется сплайсосомой – это нуклеопротеид, содержащий ряд белков и малую ядерную РНК. В начале происходит выпетливание интронов, при этом остаются только кодирующие последовательности – экзоны. Ферменты эндонуклеазы разрезают, а лигазы сшивают оставшиеся экзоны. Т.О. интроны уходят. Альтернативный сплайсинг – на одной последовательности нуклеиновой кислоты РНК образуют несколько белков. Самосплайсинг – самостоятельное удаление интронов. Нарушение сплайсинга: 1) системная красная волчанка. 2) фенилкетонурия. 3) гемоглобинопатия. Матричная РНК прокариот не подвергается процессингу, т.к. у них не интронов. Процессинг тРНК. Предшественник тРНК расщепляется и отщепляется нуклеотид 5’-3’ Q P. К 3’-концу присоединяется последовательность ССА с ОН-группой, на 5’ конце фосфорилированое пуриновое основание. Дугидроуридиновая петля – АРСаза. Процессинг рРНК. Предшественник рРНК – прорибосомальная РНК 45S синтезируется в ядрышке и подвергается действию рибонуклеаз и образуется 5,8S 18S 28S. Они на 70% спирализуются. рРНК играет роль в формировании рибосомы и участвует в каталитических процессах. Субъединица формируется из рРНК в ядре. Малая субъединица 30S, большая субъединица 50S и образуется рибосома 70S у прокариот, у эукариот 40S + 60S = 80S. Формирование рибосом происходит в цитоплазме.

Участки рибосом для связывания РНК: 1) в малых субъединицах, у которых есть последовательность Шайна-Далгорна мРНК 5’ГГАГГ3’ 3’ЦЦУЦЦ5’. Матричная РНК крепится к малой субъединице. У эукариот КЭП-связывающий участок для мРНК. Участок для связывания с тРНК: а) Р-участок – пептидильный центр для связывания мРНК с растущей пептидной цепью – пептидил-тРНК-связывающий. б) А-участок – для связи тРНК с аминокислотой – аминоацильный участок 2) В большой субъединице Е-участок с пептидилтрансферазной активность.

Обратная транскрипция характерна для ретровирусов или вирусы содержащие РНК – вирус ВИЧ-инфекции, онковирусы.

На цепочке РНК происходит синтез ДНК под действием фермента обратной транскриптазы или ревертазы, или ДНК_РНК-полимераза. Внедряясь в клетку хозяина происходит синтез ДНК, в которая встраивается в ДНК хозяина и начинается транскрипция своих РНК и синтез собственных белков.

Генетический код, его характеристика. Генетический код – это нуклеотидная последовательность молекулы рРНК в которой имеются кодовые слова для каждой аминокислоты. Он заключается в определенной последовательности расположения нуклеотидов в молекуле ДНК.

Характеристика. 1) генетический код триплетный – т.е. каждая а/к-та зашифрована тремя нуклеотидами. 2) генетический код для а/к является вырожденным или избыточным – подавляющее большинство а/к кодируется несколькими кодонами. Всего 64 триплета образуется, из них 61 триплет кодирует определенную а/к, а три триплета – АУГ, УАА, УГА являются нонсенс-кодонами, т.к. они не кодируют ни одной из 20 а/к, выполняют функцию терминации синтеза. 3) Генетический код является непрерывным, отсутствуют знаки препинания, т.е. сигналы, указывающие на конец одного триплета и начала другого. Код является линейным, однонаправленным, непрерывным. Например - АЦГУЦГАЦЦ. 4) кодоном включения синтеза служит триплет АУГ. 5) Генетический код является универсальным.

22. Трансляция – биосинтез белка. Этапы трансляции: 1) инициация. 2) элонгация. 3) терминация. Инициация – происходит активация а/к.

Инициирующая аатРНК будет взаимодействовать с 1 а/к будущего белка только карбоксильной группой, а 1 а/к может давать на синтез только NH₂ группу, т.о. синтез белка начинается с N-конца.

Сборка инициирующего комплекса на малой субчастице. Факторы: 30S мРНК фомилметионил тРНК IF 123 Mg²⁺ ГТФ – источник энергии

Нагруженная факторами инициации малая субъединица находит на мРНК старт кодон АУГ или ГУГ и по нему устанавливается рамка считывания, т.е. старт кодон помещается в Р-участок. К нему подходит формлметионил тРНК, что сопровождается высвобождением фактора IF 3, затем присоединяется большая субъединица и высвобождается IF 1 и IF2, происходит гидролиз 1ГТФ и образуется рибосома. Элонгация – рабочий цикл рибосомы. Включает в себя три шага: 1) связывание аатРНК с А-участком т.к. занят Р-участок– нужны факторы элонгации EF-TU, EF-TS и ГТФ.. 2) транспептидирование Е-участок перебрасывает а/к и образуется пептидная связь. Факторы элонгации у прокариот: EF-TU, EF-TS, EF-G. 3)Транслокация – сначала EF-G деацилированная тРНК Р-участка покидает рибосому, происходит перемещение на 1 триплет в сторону 3’ конца; перемещение пептида из А, в Р-участок – используется ГТФ и фактор элонгации – EF-G-транслоказа, А – участок опять свободен и процесс повторяется. Терминация – узнавание терминирующих кодонов УАА, УГА, УАГ с помощью релизинг-факторов RF 1 2 3. При попадании терминального кодона в А-участок к нему не присоединяется тРНК, а присоединяется один из факторов терминации, который блокирует элонгацию, что сопровождается активацией эстеразной активности пептидилтрансферазы участка Е. Происходит гидролиз сложных эфирных связей между пептидом и тРНК, рибосома покидает пептид, тРНК и диссоциирует на субъединицы, которые потом могут быть использованы.

Формирование структуры происходит одновременно с помощью белков-шаперонов – белки теплового шока. На синтез одной пептидной связи расходуется 1АТФ на аминоацилирование тРНК (присоединение аминокислоты), 1ГТФ на связь аатРНК с А-участком и 1ГТФ на транслокацию. Затрата энергии около 4 макроэргических связей на синтез одной пептидной связи.

23. Лактозный оперон. Регуляция репликации осуществляется с помощью концентрации белка Dna и гуанозинтетрафосфата. Основная регуляция экспрессии генов осуществляется на уровне транскрипции (зависит от стадии развития клетки, всех факторов, действия гормонов и других регуляторных компонентов). В разных клетках тканей только 5% генов экспрессируется, 97% молчат – мусорные ДНК – регуляторы транскрипции это хрономеры и ряд регуляторных последовательностей. Если присоединение белка-регулятора к ДНК вызывает транскрипцию, то это позитивная (+) регуляция, если подавление транскрипции – негативная (-) регуляция. Позитивная регуляция – ген выключен, присоединение белка-регулятора приводит к началу синтеза, в итоге ген включается. Т.О. белок-регулятор может быть индуктором или активатором. Негативная регуляция – ген включен, идет синтез РНК, если присоединяется белковый фактор регуляции (ингибитор или репрессор синтеза белка)Д ген выключается. Многие гормоны и другие факторы влияют на присоединение белка регулятора. Лактозный оперон E. Coli – негативная регуляция. Основные элементы его работы: в молекуле ДНК – участок регулятор, промотор, про-оперон и три структурных гена: лаг 1, лаг 2, лаг 3 и терминатор. Лаг 1 – осуществляет синтез фермента лактазы или бета-галактозидазы. Лаг 2 – фермент пермиаза, участвует в транспорте лактозы через мембрану. Лаг 3 – фермент трансацилаза. Регулятор – синтез мРНК на рибосоме, ведет к образованию белка репрессора, он присоединяется к оператору (т.к. имеет сродство), садится на него, а т.к. участки промотора и оперона перекрываются – РНК-полимераза не может присоединиться к промотору и транскрипция выключается. Глюкоза и галактоза обеспечиваю сходство репрессора и оператора. Если сходства не будет, лактоза взаимодействует с репрессором, меняя его трансформацию, и он не садится на оперон, т.к. теряет сходство к нему. РНК-полимераза садится на промотор и начинается транскрипция матричной РНК. Лактоза – это индуктор, а процесс – индукция – форма негативной регуляции, называемая так потому, что транскрипция прекращается из-за присоединения репрессора и его отщепление приводит к началу синтеза. Позитивная регуляция – ТАТА фактор – имеет сходство к участку ТАТА-бокс. ТАТА фактор садится на ТАТА-бокс – сигнал для РНК-полимеразы для узнавания своего промотора, села на него и начала транскрипцию рядом расположенных генов. У прокариот преоблалает негативная регуляция, для эукариот это не выгодно. Участки-энхансеры (усилители транскрипции) + белок-регулятор приводит к усилению транскрипции. Саинсеры + белок-регулятор  выключает транскрипцию и изменяет структуру хромосом.