logo
Методическое руководство к аудиторным занятиям

Тема: Окислительное фосфорилирование

ЦЕЛЬ: Понять, что чрезвычайно важной функцией дыхательных катализаторов, связанных с внутренней мембраной митохондрий, наряду с переброской электронов от субстратов дыхания на кислород, является аккумуляция части освобождающейся энергии в фосфатных связях высокоэргических соединений (АТФ).

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ.

  1. Макроэргические соединения, характеристика макроэргической химической связи. Биологическая роль этих соединений.

  2. Строение митохондрий. Структурная организация цепи переноса электронов и протонов, ферментные комплексы, катализирующие перенос электронов от субстрата на кислород.

  3. Разность редокс-потенциалов субстратов и кислорода как источник энергии окислительного фосфорилирования.

  4. На каких этапах тканевого дыхания высвобождается энергия, используемая для синтеза АТФ.

  5. Коэффициент Р/О, его сущность, величины.

  6. Гипотезы синтеза АТФ, их сущность.

  7. Специфические ингибиторы ферментов цепи переноса электронов, их использование для идентификации пунктов сопряжения окисления с фосфорилированием.

  8. Разобщение дыхания и фосфорилирования, значение данного явления. Разобщающие агенты.

  9. Регуляция и нарушение тканевого дыхания и аккумуляция энергии. Дыхательный контроль.

  10. Микросомальное окисление, организация цепи переноса электронов, роль цитохрома Р450. Биологическое значение этого процесса. Значение пентозофосфатного пути окисления глюкозы для организации работы этой ЦПЭ.

Пользуясь схемой митохондриальной цепи (см. выше) и схемой действия ингибиторов ЦПЭ, ответьте на следующие вопросы:

Ингибирование ферментов ЦПЭ

Субстрат

Ротенон ФАДН2 Антимицин А

Амобарбитал Карбо- – БАЛ

_ ксин

НАДН•Н+

НАДН-дегидро- QH2 QH2-дегидрогеназа

геназа ФМН в с

H2S, CO, CN–

–

цитохром С цитохромоксидаза ½О2

а а3

  1. Выберите из перечисленных реакций те, которые непосредственно сопряжены с синтезом АТФ:

А . НАДН•Н+ + Q НАД+ + QH2

Б . Сукцинат + Q Фумарат + QH2

В . QH2 + 2 цит.С (Fe3+) Q + 2 цит.С (Fe2+) + 2 Н+

Г . Изоцитрат + НАД+ α-кетоглутарат + НАДН•Н+

Д . Малат + НАД+ оксалоацетат + НАДН+Н+

  1. Объясните, почему при отравлении 2,4-динитрофенолом отмечается у пациентов тяжёлая пирогенная реакция (подъём температуры).

  2. Объясните механизм токсического действия на организм барбитуратов, цианидов.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА.

Определение макроэргических соединений скелетных мышц (АТФ и креатинфосфата)

Принцип метода: Метод основан на том, что два последних остатка фосфорной кислоты в АТФ, богатые энергией, так же, как и фосфорный остаток в креатинфосфате, легко отщепляются при непродолжительном гидролизе в кислой среде – так называемый лабильно связанный фосфор. Сравнение содержания неорганического фосфора в пробах до гидролиза и после гидролиза даёт представление о количестве лабильно связанного фосфора, приходящегося на долю макроэргических соединений. Количество неорганического фосфора определяют по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.

Порядок выполнения работы.

  1. Получение безбелкового экстракта, содержащего АТФ и креатинфосфат. Все процедуры выполняют на холоду, поместив пробирки в стакан со льдом. Растирают 0,5 г мышцы до получения кашицы, затем переносят её в пробирку с пятью мл охлаждённого 2,5 % раствора трихлоруксусной кислоты и в течение пяти минут продолжают растирать мышечную кашицу (на холоду!). Затем экстракт фильтруют. Осадок мышечной кашицы на фильтре промывают пятью мл дистиллированной воды. Этот фильтрат объединяют с первым и доводят общий объём до 10 мл дистиллированной водой.

  2. Проведение гидролиза. В две пробирки (опыт, контроль) вносят по 0,5 мл безбелкового фильтрата и по 1 мл раствора соляной кислоты 1Н, в контрольную пробу добавляют равный объём 1Н раствора едкого натра. Опытную пробирку помещают на 10 минут в кипящую водяную баню (гидролиз), затем содержимое пробирки охлаждают и добавляют 1 мл 1Н раствора едкого натра (для нейтрализации кислоты). В обеих пробирках доводят общий объём до 10 мл дистиллированной водой.

  3. Определение неорганического фосфора. Из обеих пробирок отбирают по 5 мл жидкости и добавляют 0,5 мл 1% раствора молибдата аммония, 0,5 мл 1% раствора аскорбиновой кислоты и 2 мл воды. Через 10 минут пробы колориметрируют на ФЭКе (длина волны 670 нм) против воды. Находят разность между оптической плотностью опытной пробы и контрольной (соответствует лабильно связанному фосфору). Содержание лабильно связанного фосфора находят по калибровочному графику. Расчёт проводят в мг на 100 г сырой ткани с учётом разведения.

Х = А • 3,3 • 40 • 100

ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ. Основная:

  1. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2002, с. 311-314.

  2. Биохимия: Учебник/Под ред. Е.С. Северина. –М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003, (Серия XXI век), с. 276-281, 618-621.

  3. Николаев А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2001, с. 209-212, 221-223.

  4. Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В. Биохимия: Учебник. –М.: Медицина, 2000, с. 76-79.

  5. Лекционный материал.

Дополнительная литература:

  1. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами /Под ред. Члена- корренспондента РАН, проф. Е.С. Северина, проф. А.Я. Николаева. М.: ГЭОТАР-МЕД. 2001. -448 с.: ил. – (XXI век).

  2. Марри Р. и соавтор. ‘‘Биохимия человека’’ М.: Мир, 1993, т. 1.

  3. Скулачёв Б.П. ‘‘Биоэнергетика. Мембранное преобразование энергии’’, М.: Высшая школа, 1989.