Методическое руководство к аудиторным занятиям

Тема: Физико-химические свойства белков.

ЦЕЛЬ: Выполняя реакции осаждения белков, закрепить знания об основных физико-химических свойствах белков. Научиться объяснять особенности свойств белков их строением и, наоборот, зная физико-химические свойства, аминокислотный состав белков, уметь составить представление о строении молекулы и её биологической роли.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ

Физико-химические свойства белков:

А) амфотерные свойства белков, схема диссоциации карбоксильных групп в составе белка;

Б) растворимость белков, гидратация белковой молекулы, коллоидный характер белковых растворов;

В) ионизация белка, изоэлектрическая точка, влияние рН раствора на заряд белковой молекулы.

Условия осаждения белков из растворов:

А) физико-химические механизмы высаливания, способы обратимого осаждения белков, их дальнейшая очистка методом диализа;

Б) денатурация, физико-химические основы, факторы, вызывающие денатурацию белков (физические и химические), ренатурация;

В) использование методов высаливания белков и денатурации в медицине.

Типы гидролиза белка. Какие промежуточные и конечные продукты образуются при гидролизе белка?
Молекулярная масса белков. В каких пределах колеблется, какие методы используются для её определения?
Представление о механизмах разделения белков, пептидов, аминокислот (гельфильтрация, бумажная распределительная и ионообменная хроматография, электрофорез).
Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови. Протеинограмма здорового человека. Изменения при некоторых заболеваниях.
Последовательность действий, направленных на выделение, фракционирование белка, очистку и установление его однородности.

СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ.

Таблица 1. Методы разделения и очистки белков.

Название метода	Принцип метода
Высаливание	Метод основан на различной устойчивости белков в растворе. Осаждение белков происходит при различной степени насыщения растворов сульфатом аммония, а также солями щелочных и щелочноземельных металлов. Нативная структура белков сохраняется.
Диализ	Метод основан на неспособности белков проходить через полупроницаемую мембрану, в то время как низкомолекулярные вещества проходят через неё. Применяется для очистки белков от низкомолекулярных примесей (например, после процедуры высаливания).
Гель-фильтрация	Метод основан на различиях белков по молекулярной массе. Чем выше молекулярная масса, тем быстрее белок проходит через колонку, заполненную смолой (Сефадекс). Используется для разделения белков по молекулярной массе, для определения молекулярной массы белков, для очистки белков от низкомолекулярных примесей.
Ультрацентрифугиро-вание	Метод основан на зависимости скорости седиментации молекул под действием центробежной силы от молекулярной массы.
Электрофорез	Метод основан на различиях белков по величине суммарного заряда и вследствие этого различной скорости движения белков в поле постоянного электрического тока.
Бумажная хроматография (распределительная)	Метод основан на различной растворимости в полярных (Н₂О) и неполярных (например, бутанол) растворителях.
Ионообменная хроматография	Метод основан на взаимодействии заряженных групп белка с ионными группами полимеров (анионо-, катионообменниками).
Афинная хроматография	Метод основан на связывании белка специфическим лигандом, ковалентно присоединённым к нерастворимому полимеру.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА.

I. Выполнить работу по разделению альбуминов и глобулинов яичного белка методом высаливания. Сделать вывод о сравнительной устойчивости альбумина и глобулина в растворе. Объяснить, почему раствор альбумина более устойчив. Материал исследования: 3% раствор яичного белка в 1%-ном растворе хлорида натрия.

Реактивы: дистиллированная вода, хлорид натрия, сухой порошок; сернокислый аммоний, насыщенный раствор; сернокислый аммоний, сухой порошок.

Порядок выполнения работы:

А) К 1 мл раствора яичного белка добавляют 9 мл Н₂О дист. Наблюдается помутнение раствора (глобулины растворяются в слабых растворах солей, но не растворяются в дист. воде).

Б) К 1 мл раствора яичного белка добавляют хлорид натрия (порошок) до насыщения. Выпадает белый аморфный осадок глобулинов. Через 10 минут осадок отфильтровывают. Фильтрат кипятят, наблюдают выпадение осадка (альбумин).

В) К 1 мл раствора яичного белка добавляют 1 мл насыщенного раствора сернокислого аммония. Выпадает осадок глобулинов. Осадок отфильтровывают и к фильтрату добавляют порошок сернокислого аммония до насыщения. Образуется осадок яичного альбумина, который всплывает вверх вследствие высокой плотности жидкости. Осадок отфильтровать и доказать качественными реакциями на белок или осадочными пробами, что в фильтрате белка нет.

Результаты опыта внести в таблицу:

Название белка	Соль и степень насыщения	Результат опыта

II. Познакомиться с методами очистки белков от низкомолекулярных примесей (гель-фильтрация, диализ). Выполнить работу по очистке белка методом диализа.

Материал исследования: яичный альбумин, 3% раствор.

Реактивы: сернокислый аммоний, насыщенный раствор; хлорид бария, 5% раствор; сернокислая медь, 1% раствор; гидроксид натрия, 10% раствор.

Порядок выполнения работы: Из листа предварительно смоченного дист. водой целлофана делают мешочек (диализатор). В него вносят 2 мл раствора альбумина и 1 каплю раствора сернокислого аммония. Края мешочка зажимают между стеклянными палочками, фиксируют их. Мешочек помещают в стакан с дистиллированной водой так, чтобы уровень жидкости в мешочке был ниже уровня жидкости в стакане. Через 1 час от начала диализа берут в две пробирки по 1 мл жидкости из стакана и проделывают две реакции:

А) на присутствие сернокислых ионов – добавляют в первую пробирку 3 – 4 капли раствора хлорида бария и наблюдают образование осадка сернокислого бария в виде мути;

Б) во второй пробирке проводят биуретовую реакцию на обнаружение белка;

В) жидкость из мешочка сливают, берут 10 капель раствора, проводят биуретовую реакцию.

Делают выводы.

III. Пронаблюдать денатурацию белков.

В качестве денатурирующих агентов используют соли тяжёлых металлов, органические кислоты, алкалоиды.

Материал исследования: яичный альбумин, 3% раствор.

Реактивы: сернокислая медь, 1% раствор; уксуснокислый свинец, 5% раствор; сульфосалициловая кислота; таннин, насыщенный раствор.

Порядок выполнения работы: В четыре пробирки вносят по 5 капель раствора белка и добавляют по 1 – 2 капле указанных выше реагентов. Наблюдают выпадение осадков. В пробирки № 1 и № 2 добавляют ещё 5 – 10 капель соответственно растворов сернокислой меди и уксуснокислого свинца. Наблюдают исчезновение осадков (адсорбционная пептизация вследствие появления одноимённого положительного заряда на частицах белка). Однако в воде осадки не растворяются, что доказывает необратимость реакции осаждения.

Объяснить, почему при отравлениях солями тяжёлых металлов (ртути, свинца, меди) применяют в качестве противоядия молоко, яйца.

Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.

Порядок выполнения работы: К 5 каплям концентрированной азотной кислоты прибавляют равный объём раствора белка, осторожно, по стенке пробирки, наклонив её под углом в 45. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирку, добавляют избыток азотной кислоты, осадок не исчезает. (При использовании других минеральных кислот осадки ‘‘растворяются’’ в избытке кислот). Реакция осаждения белка концентрированной азотной кислотой используется в клиническом анализе мочи.

ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ. Основная:

Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2002, с. 23-33, 44-49.
Биохимия: Учебник/Под ред. Е.С. Северина. –М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003., (Серия XXI век), с. 39-45, 67-73.
Николаев А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2001, с. 28-29, 36-42, 48-53.

Дополнительная литература:

Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами /Под ред. Члена-корренспондента РАН, проф. Е.С. Северина, проф. А.Я. Николаева. М.: ГЭОТАР-МЕД. 2001. -448 с.: ил. – (XXI век).
Марри Р. и соавтор. ‘‘Биохимия человека’’ М.: Мир, 1993, т. 1.

Содержание