4.3. Здійснення уф-мутагенезу штаму-продуценту треоніну

На першому етапі дослідження було визначено вплив УФ-опромінення на життєздатність клітин штаму B. flavum ТН7. Як контроль брали відповідні розведення неопроміненої суспензії бактерій. Життєздатність клітин встановлювали до та після УФ-опромінення бактеріальної суспензії. Кількість клітин в популяції, що виживали, визначали за кількістю утворених колоній на МПАзб. і залежно від тривалості дії УФ-опромінення. Контролем слугувала неопромінена бактеріальна суспензія.

Для визначення летальної дози штам B. flavum ТН7 опромінювали протягом 12 хв. Для мутагенезу був визначений оптимальний термін опромінення – 10 хв (рис. 4.5).

Рис. 4.5 Життєздатність клітин B. flavum ТН7 під дією УФ-опромінення

Примітка. Контролем слугував показник КУО (100%) в неопроміненій бактеріальній суспензії

Критерій відбору мутантів – ауксотрофність та стійкість до аналогу треоніну НВ. З популяції виживших клітин у невеликих розведеннях виявлено мутантні клони. Серед всіх клонів, отриманих дією УФ на клітини B. flavum ТН7, для подальшого дослідження відібрали 8 та перевірили їх на накопичення цільової амінокислоти (рис. 4.6). Отримані мутантні штами показали підвищення рівня наукопичення треоніну більш ніж в 2 рази.

Аналіз регуляторної та аналогорезистентної ауксотрофності і відбір мутантів. Стійкість до аналогів амінокислот можуть викликати мутації, які блокують надходження амінокислот до клітини. Було проведено декілька етапів селекції, використовуючи поступове підвищення концентрації НВ від 0,25 мг/дм³ до 0,4 мг/дм³.

*

Рис. 4.6 Накопичення треоніну мутантними штамами B. flavum ТН7

Примітка: 1 – штам до опромінення УФ; 2-9 – отримані УФ-мутанти.

Контролем слугував показник синтезу треоніну штамом до опромінення.

Опромінену бактеріальну суспензію висівали глибинним способом на МПАзб. (для встановлення титру клітин), МС з лейцином або гомосерином, та з НВ (для відбору мутантів за критеріями ауксотрофності та аналогорезистентності). Отримані результати представлено в табл. 4.4. Відбір мутантів здійснювали за критеріями ауксотрофності та стійкості до НВ продуцентів треоніну. Отримано НВ-стійкі продуценти треоніну з частотою мутацій (1,4±0,2)x10^-3.

Таблиця 4.4