4.7. Порівняння послідовностей гена 16s рРнк у різних штамів-продуцентів треоніну

Для підтвердження таксономічного положення отриманого мутантного штаму треоніну визначили послідовності гена 16S рРНК штамів-продуцентів треоніну з Колекції та встановили їх філогенетичне положення в межах найбільш споріднених штамів роду Brevibacterium з бази даних «GenBank» [166].

Ампліфікацію гена 16S рРНК здійснювали з використанням універсальних бактеріальних праймерів 27f та 1492r з подальшим сиквенуванням.

Для порівняння вихідного та мутантного штамів-продуцентів треоніну з Колекції було виділено ДНК цих бактерій і визначено нуклеотидну послідовність гена 16S рРНК. Виділену ДНК було перевірено на чистоту за допомогою електрофорезу (рис. 4.10).

Рис. 4.10 Електрофореграма ПЛР аналізу та наявність фрагменту гена 16S рРНК (27f-1492r): 1 – B. flavum TH7; 2– B. flavum ІМВ В-7446

Ампліфікацію гена за 16S рРНК здійснювали за допомогою універсальних бактеріальних праймерів 27f та 1492r. Після ампліфікації гена 16S рРНК визначили нуклеотидну послідовність отриманого амплікону.

Нуклеотидні послідовності гена 16S рРНК штамів B. flavum TH7 та B. flavum ІМВ В-7446 наведено нижче.

B. flavum TH7

GGAAAAAAGGAATCAGCATATCAAAGTCTCTGCCCTAAGAGAGTTGGGCTACTGGCTTCGGGTGTTACCAACTTTCATGA CGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTT CATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGGCCGGCTTTAAGAGATTAGCTCCACCTCACGGTGTGGCAACTCG CTGTACCGACCATTGTAGCATGTGTGAAGCCCTGGACATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGA GTTAACCCCGGCAGTCTCTCATGAGTACCCACCACAATGTGCTGGCAACATAAGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACT TAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTGAACCGACCACAAGGGAAAACGTATCTCTAC GCCGATCCGGTCCATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGG GCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACAG AAGTCGTGGAAGACCCCTACACCTAGCGCCCACCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCA TGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTTACTGCCCAGAGACCCTGCCTTTCGCATTGGTGTCCTCCTGATATTCTGCGCATTT CACGCTACACAGGATTTCCAGTCTCCCTTACAGCACTCAAGTATGCCGTAATCGGCTGGCACGCCCCGAAGGTTAAAGC

B. flavum ІМВ В-7446

GGAAAGGGCCATCACCTTCGAAGCTCCCCCCTAAAGGTTGGGCCACTGGCTTCGGGTGTTACCAACTTTCATGACGTGAC GGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGG GTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGGCCGGCTTTAAGAGATTAGCTCCACCTCACGGTGTGGCAACTCGCTGTAC CGACCATTGTAGCATGTGTGAAGCCCTGGACATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTAAC CCCGGCAGTCTCTCATGAGTACCCACCACAATGTGCTGGCAACATAAGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCC AACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTGAACCGACCACAAGGGAAAACGTATCTCTACGCCGAT CCGGTCCATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCC GTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACAGAAGTCG TGGAAGACCCCTACACCTAGCGCCCACCGTTTACGGCATGTACTACCAGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTC GCTCCTCAGCGTCAGTTACTGCCCAGAGACCTGCCTTTCGCATTGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACGCTACA CCAGGATTTCCAGTCTCCCTCACAGCACTCAGTATGGCCCGTATTCGACCTTGCCAACCGCCCCCGAAGGT

Вирівнювання отриманих нуклеотидних послідовностей проведено в програмі ClustalW [169].

 Brevibacterium_flavum_ТН7_  comp_Seq  Brevibacterium_flavum_IMB B-7446_comp_SeqGGCAATTGCGGCATTCTTACCATGTCAGTCGAACGCTGAACCAGAACTTG 50GGAAGGGGCGGCAT-CTTACCATG-CAGTCG-ACGCTGAACCAGAGCTTG 47**.*. ******* ********* ****** *************.****CTTTGGTGGATAAGTGGCGAACGGGTGTGTAACACGTGGGTGATCTGCCC 100CTTTGTTGGATAAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCC 97***** *********************:**********************TACACTTTGGGATAAACCTGGGAAACTGGGTCTAATACCCAATATTCTCA 150TCCACTTTGGGATATACCTGGGAAACTGGGTCTAATACCCAATATTCTCA 147*.************:***********************************CCCCCCCATGGGTGGGGTGGAAAGCTTTGTGCGGTGTGGGATGAGCCTGC 200CCCCCCCATGGGTGGGGTGGAAAGCTTTGTGCGGGGTGGGATGAGCCTGC 197********************************** ***************GGCCTATCACCTTGTTGGTGGGGTAATGGGCTACCAAGGCGTCTACAGGT 250GGCCTATCACCTTGTTGGTGGGGTAATGGGCTACCAAGGCGTCTACAGGG 247************************************************* AGCCGGCCTGAGAGGGTGTACGGCCACATTGTGACTGAGACACGGCCCCC 300ATCCGGCCTGAGAGGGTGTACGGCCACATTGTGACTGAGACACGGCCCCC 297* ************************************************ACTCCTACGGGAGGCGCCACTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGCAAGCCT 350ACTCCTACAGGAGGCGCCACTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGCACGCCT 347********.************************************.****GATGCACCGACACCCCGTGGGGGATAAAAGCCTTCTGGTTGTAAACTCCT 400GATGCACCGACACCCCGTGGGGGATAAAAGCCTTCTGGTTGTAAACTCCT 397**************************************************TTCTCTATGGACAAAACCTTTTGGTGACGGTACCTGGAGAAAAAACACCG 450TTCTCTATGGACAAAACCTTTTGGTGACGGTACCTGGAGAAAAAACACCG 447**************************************************GCTAACTACGTGCCACCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTC 500GCTAACTACGTGCCACCAGCCGCGGTAATACATAGGGTGCGAGCGTTGTC 497*******************************.******************CCGAATTACTGGGCGTAAAAAGCTCTTAGGTGGTTTGTCGCGTCGTCTGT 550CGGAAATACTGGGCGTAAAAAGCTCTTAGGTGGTTTGTCGCGTCGTCTGT 547* ***:********************************************GAAATCCCGGGGCTTATCTTCTGGCGTGCAGGCGATACAGG-CATAACTT 599GAAATCCCGGGGCTTATCTTCTGGCGTGCAGGCGATACAGGGCATAACTT 597***************************************** ********GTGTGCTGTA-GGGGAGACTGGAATTCCTCGTGTAGCGGTGAAATGCGCA 648GAGTGCTGTATGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCA 647*:******** ****************** ********************CATATCACGAGGAGCACCCCTGGGGAAAGCAGGGTCTCTGGGGCACTAAC 698CATATCACGAGGGAAAACCAATGGCGAAGGCGGGTCTCTGTGGCACTAAC 697************...*.**.: ** .*** .********* *********CTCTCGCTGAGGAAGCGAAAAACCATGGGGTATCGCACAAGGAATTATTA 748TG-ACGCTCAG-GAGCG-AAAAACATGTGGTATCGCACAACGATT--ATA 742:**** ** .**** ****.**** ************ **:* :**TACCCCTGGGGAGTCCCATGCCCCTAAAACAGCTGGGGGCGCCTACGATG 798TAACCCTGGTGAGTGCACTGCCGC--AAACAGCTGG--GCGCTATG--TG 786**.****** **** *..**** * ********** **** :: **GTATGGGGGTGCTTTTCACGAACATACTGGTGGCGGCAGCCTAACACATT 848GTAGGGG---TCTTTCCTACGACGATCTG-TGTCG-CAGCCTAATCGGCC 831*** *** **** *:. .**.::*** ** ** ******** . . TATATACGCCCCCCCCCCTGGTGGGAGTACCAGCCGGCCCCAGGGCGTCA 898ATTATAA-CGCCCCGCTCTGGTGG-AGTACTAGCCCGTCAACG-----CC 874::****. * **** * ******* ***** **** * *...*  *.TAACTCTCTCAAGGGAGAATATATGATGCACGGGCGGGGCTGGGTCGCTT 948CTAAACTCCTAGGAGAGAATGGTT-----ACAG-CGG------------- 905:*.:*** *.*.******. :*  **.* ***    ACTACAACGCTTTAACCTTCGGGG-CG---TGCCAG-CCGATTACGG--C 991--------------ACCTTCGGGGGCGGTTGGCAAGGTCGAATACGGGCC 941********** ** **.** ***:***** *ATACTTGAGTGCTGTAAGGGAGACTGGAAATCCTG-TGTAGCGTGAAATG 1040ATACT-GAGTGCTGTGAGGGAGACTGGAAATCCTGGTGTAGCGTGAAATG 990***** *********.******************* **************CGCAGAATATCAGGAG-GACACCAATGCGAAAGGCAGGGTCTCTGGGCAG 1089CGCAG-ATATCAGGAGGAACACCAATGCGAAAGGCAGG-TCTCTGGGCAG 1038***** ********** .******************** ***********TAAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATAC 1139-TAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATAC 1087:************************************************CCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTAGGGGTCTTCCA 1189C-TGGTAGTACATGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTAGGGGTCTTCCA 1136* *******.****************************************CGACTTCTGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACG 1239CGACTTCTGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACG 1186**************************************************GCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCG 1289GCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCG 1236**************************************************GAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGA 1339GAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGA 1286**************************************************CATGGACCGGATCGGCGTAGAGATACGTTTTCCCTTGTGGTCGGTTCACA 1389CATGGACCGGATCGGCGTAGAGATACGTTTTCCCTTGTGGTCGGTTCACA 1336**************************************************GGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTC 1439GGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTC 1386**************************************************CCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTATGTTGCCAGCACATTGTGGTGGGT 1489CCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTATGTTGCCAGCACATTGTGGTGGGT 1436**************************************************ACTCATGAGAGACTGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTC 1539ACTCATGAGAGACTGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTC 1486**************************************************AAATCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGTCG 1589AAATCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGTCG 1536**************************************************GTACAGCGAGTTGCCACACCGTGAGGTGGAGCTAATCTCTTAAAGCCGGC 1639GTACAGCGAGTTGCCACACCGTGAGGTGGAGCTAATCTCTTAAAGCCGGC 1586**************************************************CTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCT 1689CTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCT 1636**************************************************AGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTA 1739AGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTA 1686**************************************************CACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCAGTAGCC 1789CACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCAGTGGCC 1736**********************************************.***CAACTCTCTTAGGGCAGAGACTTTGATATGCTGATTCCTTTTTTCC 1835CAAC---CTTTAGGGGGGAGCTTCGAAGG--TGATGGCCCTTTCC- 1776**** ***:.** .*...*** **:. **** * *** * 

Для визначення родинних зв'язків був проведений філогенетичний аналіз і побудовано філогенетичне дерево. Мірою відповідності набору вирівняних послідовностей даної топології вважається міра (критерій), заснована на принципі найбільшої правдоподібності. Була досліджена дендрограма філогенетичних зв’язків штамів B. flavum ТН7, B. flavum ІМВ В-7446 з Колекції та філогенетично близьких представників родів Brevibacterium, Corynebacterium і Kocuria.

Нижче наведено філогенетичне дерево з найвищим значенням логарифму подібності (log-likelihood value) – 2171,38, побудоване за допомогою методу максимальної правдоподібності (мaximum likelihood) з використанням моделі Tamura-Nei для оцінки еволюційної відстані. Кількість повторів (bootstrap) – 1000 (рис. 4.11). Філогенетичне дерево, побудоване іншим статистичним методом приєднання сусідів (Neighbor-joining), мало таку ж топологію.

Досліджувані штами знаходились на дендрограмі в одній групі з типовими штамами виду Corynebacterium glutamicum. Ця група виділена з 100% вірогідністю (Bootstrap аналізу) від іншої групи, утвореної представниками родів Brevibacterium і Kocuria. Проведений аналіз показав, що штами Brevibacterium flavum TH7 та Brevibacterium flavum IMВ B-7446 відносяться до виду Corynebacterium glutamicum.

Необхідно звернути увагу, що штами, які відносилися до родів Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Micrococcus або Artrobacter, та ін., Brevibacterium chang-fua, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium glutamigenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium seonmiso, Brevibacterium sp., Brevibacterium taipei, Brevibacterium thiogenitalis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium herculis, Microbacterium ammoniaphilum, Microbacterium sp., Micrococcus maripunicenus, Artrobacter sp., після чисельних таксономічних досліджень виявились в кластері Corynebacterium glutamicum [183].

Рис. 4.11 Філогенетичне положення штамів B. flavum TH7 та B. flavum IMV B-7446 серед представників родів Brevibacterium, Kocuria та Corynebacterium на основі послідовності гена 16S рРНК

Необхідно відзначити, що жоден з продуцентів амінокислот роду Brevibacterium, не був справжнім членом роду Brevibacterium. Отже, численні штами були перекласифіковані як С. glutamicum. Вміст нуклеотидів (G + C) для штамів С. glutamicum знаходились в інтервалі від 53 до 58 % mol. Вміст нуклеотидів (G + C) штаму C. glutamicum ATCC 13032 склав 53,8 % mol., вміст (G + C) для мутантного штаму B. flavum IMВ B-7446 склав 55,4% mol.

Невідповідність, виявлену в ідентифікації на основі комплексу морфологічних і фізіолого-біохімічних особливостей та аналізування сиквенування гену 16S рРНК можна пояснити досягнутій нещодавно рекласифікації деяких видів Brevibacterium як Corynebacterium [130]. Таким чином, в подальшому необхідно провести детальне аналізування (повний сиквенс) для точної ідентифікації отриманого штаму.

Основні результати даного розділу опубліковані в наукових роботах [184, 187-189].