Розділ 5 узагальнення отриманих результатів

Дослідження здійснено для вдосконалення штамів-продуцентів незамінних амінокислот лізину і треоніну роду Brevibacterium. Для цього було проведено фізичний та хімічний мутагенез та оптимізовано умови культивування штамів-продуцентів.

Встановлено, що після зберігання та пересівів продуценти лізину Brevibacterium sp. 90H, Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. Е531 дали розщеплення на два типи колоній (без пігменту і пігментовані), а продуцент треоніну B. flavum ТН7 утворював тільки жовті колонії. Виявлено, що жовті колонії синтезують більше лізину, ніж без пігменту (біло-сірі) колонії. Встановлено ауксотрофність клонів з найбільшою продуктивністю за цільовими амінокислотами. Виявлено, що клони зберігають ауксотрофність за лейцином і набувають нову залежність до треоніну, метіоніну, триптофану, ізолейцину. Встановлено, що продуцент треоніну B. flavum ТН7 був ауксотрофом за серином і лейцином.

Здійснено мутагенез штамів Brevibacterium sp. 90H, Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. Е531, B. flavum ТН7 за допомогою УФ опромінення і отримано стійкі мутантні штами-продуценти лізину і треоніну Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 і B. flavum ІМВ В-7446, відповідно. Відбір мутантів здійснювали за критеріями ауксотрофності та стійкості до аналогів лізину і треоніну (АЕЦ і НВ, відповідно). Отримано АЕЦ-стійкі продуценти лізину з частотою мутацій (1,1±0,2)x10^-3 та НВ-стійкі продуценти треоніну з частотою мутацій (1,4±0,2)x10^-3.

Перевірено вихідну культуру і отримані мутантні штами на чутливість до антибіотиків з метою встановлення генетичних маркерів вихідну культуру і отримані мутантні штами. Виявлено, що мутантний штам Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 змінив чутливість до левоміцетину, а штам B. flavum ІМВ В-7446 – до тетрацикліну. З метою визначення стабільності отриманих мутантних штамів їх пересівали протягом двох місяців з інтервалом два тижні на тверде та рідке середовище з визначенням кількості синтезованого треоніну і лізину. Накопичення амінокислот не змінювалось від пересіву до пересіву, що свідчить про стійкість мутації.

Визначено, що кількість лізину і треоніну, яку синтезували отримані за допомогою хімічного мутагенезу штами, не перевищувала їх кількість у вихідних штамів. Отримані колонії рожевого кольору (вихідний штам – Brevibacterium sp. ІМВ В-7447) поверталися до вихідного жовтого забарвлення, що свідчить про нестійкість мутації. Подальші дослідження мутантних штамів, отриманих таким способом, не проводили.

Виявлено при проведенні порівняльного аналізу гена 16S рРНК мутантних штамів з вихідними штамами і штамами з бази даних «GenBank», що штами-продуценти з Колекції належать до трьох груп. До першої належать штами Brevibacterium sp. 90Н, Brevibacterium sp. FXJ8.052, Brevibacterium casei DY 40-62, Brevibacterium ammoniilyticum A1, до другої – Brevibacterium sp. Е531, Brevibacterium sp. BS05, до третьої – Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. TUT і отриманий мутантний штам Brevibacterium sp. ІМВ В-7447. Встановлено, що гомологія нуклеотидних послідовностей гена 16S рРНК Brevibacterium sp. 90 і Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 становить 98%.

Визначено, що штами B. flavum TH7 і B. flavum IMВ B-7446 належать до виду Corynebacterium glutamicum. Невідповідність, виявлену в ідентифікації на основі сиквенування гена 16S рРНК можна пояснити досягнутій нещодавно рекласифікації деяких видів Brevibacterium як Corynebacterium. В подальшому необхідно провести детальне аналізування (повний сиквенс) для точної ідентифікації отриманого штаму. Встановлено, що мутантний штам Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 не має аналогів в базі даних «GenBank».

Показано, що оптимізація умов культивування штаму Brevibacterium sp. ІМВ В-7 447 дозволила підвищити синтез лізину в 8 разів. Оптимальними умовами були рН 7,0, Т = 31 ± 1 ° С, кількість кисню 3-4 гО₂/дм³/год, тривалість культивування 72 год, джерела вуглеводів – сахароза або меляса (8%), джерела азоту – сірчанокислий амоній (4%), ростові фактори – біотин, кукурудзяний або дріжджовий екстракт.

Визначено, що штам B. flavum ІМВ В-7446 синтезував в 6 разів більше треоніну в порівнянні з вихідним штамом за рахунок оптимізації умов культивування (рН 7,0, температура 32 ± 1 ° С, кількість посівного матеріалу 20%, кількість кисню 11 гО₂/дм³/год, тривалість культивування 72 год, джерела вуглеводів – сахароза або меляса, джерела азоту – сірчанокислий амоній, визначені оптимальні концентрації ростових факторів в середовищі (г/дм³): проліну – 0,8; тіаміну – 0,002; біотину – 2,0х10^-4; дріжджового екстракту – 1,0, підібрано оптимальну концентрацію суміші ізолейцина і метіоніна (з вмістом 0,4 г/дм³ кожної амінокислоти).

Отримані в роботі штами B. flavum ІМВ В-7446 (C. glutamicum) і Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 депоновані в «Національному Депозитарії мікроорганізмів» Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. Послідовності гена 16S рРНК мутантних штамів зареєстровані в базі даних «GenBank» (реєстраційні номери KT151946 і KT151948 відповідно).