2.5. Філогенетичний аналіз

Реактиви. Приготування реагентів для біохімічних та електрофоретичних досліджень здійснювали на очищеній та деіонізованій воді (система «DIRECT Q3», «Мilipore», Франція).

Для виділення та аналізу геномної ДНК використовували: набір реагентів з протоколами для виділення вищезазначених ДНК бревібактерій («Fermentas», Литва), а також агарозу ("Sigma", США), бромід етидію (базовий розчин концентрацією 10 г/дм³) та бромфеноловий синій ("Sigma", США) [158, 160].

Виділення ДНК. Для виділення ДНК клітини бактерій брали з однодобової культури, отриманої на МПБзб. за температури 31±1⁰С в умовах аерації при кількості обертів 220 хв^-1. ДНК виділяли за стандартною процедурою для грампозитивних бактерій [146]. Для лізису клітин додавали 1 % лізоциму (10 мг/мл). Виділену ДНК досліджували за допомогою горизонтального електрофорезу (для встановлення чистоти ДНК та розділення на амплікони) та ПЛР (для збільшення копійності) [162 – 164]. Електрофоретичне розділення виділеної ДНК проводили в 1%-му агарозному гелі в Трис-ацетатній буферній системі. Молекулярну масу фрагментів ДНК визначали за їх електрофоретичною рухливістю, використовуючи як маркери 1kb – ДНК маркер (1kb Fermentas SM1163) [162].

Умови проведення ПЛР. Ампліфікацію гену 16S рРНК здійснювали за допомогою універсальних бактеріальних праймерів 27f та 907r (27F 5’-AGA GTT TGA TGG CTC AG-3’; 907r 5’-CCG TCA ATT CCA TTT GAG TTT-3’) та 27f і 1492r (27F 5’-AGA GTT TGA TGG CTC AG-3’; 1492r 5’-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’). ПЛР проводили на ампліфікаторі «Mastercycler personal 5332» (Eppendorf, США) з термостатованою кришкою. Реакційна суміш складалася з однократного ПЛР-буфера з сульфатом амонію, 0,2 мкМ відповідних праймерів (до фрагменту 16SRNA з 27-го по 907-й нуклеотид або з 27-го по 1492-й нуклеотид), 200 мкМ кожного з дезоксинуклеотидтрифосфатів, 0,5 од. Taq-полімерази (Fermentas, Литва), 2,0 мМ хлориду магнію, 10-50 нг ДНК-проби. Загальний об’єм реакційної суміші дорівнював 20 мкл.

Умови ампліфікації: початкова денатурація за Т=95⁰С – 3 хв; 32 цикли ампліфікації (Т=94⁰С – 30 с, Т=57⁰С – 45 с, Т=72⁰С – 30 с); кінцева елонгація відбувалася за Т=72 ⁰С протягом 5 хв [165]. Електрофоретичне розділення отриманих продуктів ампліфікації проводили в Трис-ацетатному буфері. Отриманий фрагмент виділяли з агарозного гелю за допомогою набору «Macherey-Nagel NucleoSpin Extract» згідно з інструкцією фірми-виробника та сиквенували на автоматичному сиквенаторі «ABI PRISM 310 Genetic Analyser» (Applied Biosystems). Результуючий контиг сиквенування отримували шляхом порівняння прямої та зворотньокомплементарної послідовностей з використанням програми CLC Main Workbench (CLC bio). Гомологічні послідовності відбирали з бази даних «GenBank» [166].

Порівняльний аналіз нуклеотидних послідовностей. З бази даних «GeneBank» було відібрано послідовності гена 16S рРНК різних представників родини бревібактерій, що мали найбільший рівень нуклеотидної подібності до сиквенованих фрагментів гена 16S рРНК досліджуваних штамів-продуцентів лізину. Для з’ясування систематичного положення досліджуваних штамів зі спорідненими було проведено вирівнювання відповідних нуклеотидних послідовностей в програмі ClustalW [167] та побудовано дендрограму філогенетичних зв’язків. Філогенетичний аналіз проводили в програмі MEGA6 [168, 169].