2.6. Біохімічні та фізичні методи аналізу

рН культурального середовища визначали за допомогою рН-метру «рН – 150».

Визначення кількості цукру проводили резорциновим методом згідно методики [170]. Конверсію цукру в цільову амінокислоту розраховували за формулою:

(р-р₀)=Y_p/s(S₀-S),

де р₀ – кількість амінокислоти у вихідному середовищі, р – кількість отриманого продукту (амінокислоти), S₀ – кількість сахарози у вихідному середовищі, S – кількість сахарози у культуральній рідині, Y_p/s – конверсія.

Кількість амонійного азоту визначали згідно методики з використанням реактива Несслера [171]. Визначення сухих речовин (СР) здійснювали ваговим методом (висушування при температурі 105°С до постійної маси) [172]. ОГ вимірювали за допомогою фотоелектроколориметра (модель КФК-3) в кюветах з розміром між стінками d=5 мм за довжини хвилі 440 нм [173].

Кількість синтезованих цільових амінокислот визначали за допомогою амінокислотного аналізатору «ААА-400» (Ingos, Чехія) або за допомогою тонкошарової хроматографії.

Як буферну систему для тонкошарової хроматографії використовували суміш ізопропанол:аміак:ацетон:вода у співвідношенні 50:12:50:8 [174]. Як барвник використовували розчин нінгідрину (нінгідрин – 0,5 г, ацетон – 0,06-0,07 дм³, льодова оцтова кислота – 0,001 дм³, дистильована вода – 0,004 дм³). Приготування елююючого розчину: в мірну колбу об’ємом 1 дм³ вносили 0,4 дм³ розчину етилового спирту з масовою часткою 75%, додавали 0,0005 дм³ насиченого розчину CuCl₂ та 0,004 дм³ розчину HNO₃. Об’єм в колбі доводили до мітки розчином спирту з масовою долею 75%. Використовували пластини «Silufol» 20х20.

Кількість розчиненого кисню визначали за допомогою промислового аналізатору кисню АРК-ІП (Росія). Кількість біомаси визначали за приростом ОГ, яка вимірювалась за допомого КФК-3.

Мікроскопіювання проводили за допомогою мікроскопу “Laboval4” (“Carl Zeiss”, Німеччина). Фотографії робили за допомогою фотоапарату “Canon PowerShot A640” (Японія).

Для визначення відношення до фарбування за Грамом проводили дослідження з використанням відповідних барвників. Вітальне фабування проводили з використанням барвника метиленового синього [175].

Для паспортизації штамів проводили наступні дослідження.

Активність каталази визначали методом, який базується на визначенні кількості пероксиду водню, перетвореного ензимом за певний проміжок часу.

Бактеріальну суспензію наливали по 0,001 дм³ в дві колби, додавали по 7 мл дистильованої води, в дослідну пробу додавали 0,002 дм³ 1 % Н₂О₂, а в контрольну – 0,005 дм³ 10 % розчину сірчаної кислоти. Дія каталази в кислому середовищі припинялась (в контрольній пробі), так як вона діє при рН 7,4. Колби залишали на 30 хв за кімнатної температури. До дослідної проби додавали 0,005 дм³ 10 % розчину сульфатної кислоти, а до контрольної – 0,002 дм³ 1% розчину Н₂О₂. Вміст колб титрували 0,1 н розчином КМnО₄ до рожевого забарвлення.

Каталазне число (Кч) розраховували за формулою:

Кч = (А – В) х 1,7

де: А – кількість мл 0,1н р-ну КМnО₄, яка пішла на титрування контрольної проби; В – кількість мл 0,1н р-ну КМnО₄, яка пішла на титрування дослідної проби; або згідно методу [176].

Засвоєння вуглеводів та відношення до кисню визначали за допомогою методики [177].

Для визначення розрідження желатини використовували м’ясо-пептонну желатину наступного складу (г/дм³): суха суміш поживного бульйону – 15,0, NaCl – 5,0, порізана желатина – 150,0. Середовище стерилізували протягом 30 хв за тиску 0,5 атм.

Для визначення зброджуваності цукрів використовували середовище Гіса з індикатором Андреде [178]. Нітратний азот визначали за допомогою методики [177].

Для визначення маркеру генетичних змін нових штамів-продуцентів використовували диски з антибіотиками азитроміцином, ампіциліном, цефтріаксоном, бензилпеніциліном, гентаміцином, тетрацикліном, стрептоміцином, левоміцетином і канаміцином [175].