2.2.Витальное (прижизненное) изучение клеток

С помощью светового микроскопа можно видеть живые клетки. При кратковременном наблюдении клетки помещают просто в жидкую среду на предметном стекле. В время длительного наблюдения за клетками используют специальные камеры. Это или плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкими стеклами, или же разборные плоские камеры.

В любом из этих случаев клетки изучают в специально подобранных средах. Свободноживущие одноклеточные организмы рассматривают и изучают в тех же средах, в которых они живут в естественных условиях или культивируются в лаборатории. Клетки крови или другие свободные клетки многоклеточных организмов изучают в капле плазмы или в специальных синтетических средах.

Метод клеточных культур. Используется для изучения клеток органов и тканей животных. Самый простой вариант этого метода заключается в том, что в камеру, наполненную питательной средой, помещают небольшой кусочек живой ткани. На периферии такого кусочка начинается деление и рост клеток.

При культивировании клеток вне организма обязательным условием является соблюдение стерильности, поддержание необходимой температуры (около 20^о для хладнокровных и около 37^о для теплокровных). Существует целый ряд длительно культивируемых клеток; или штаммов, приспособившихся десятилетиями к росту вне организма. В основном это клетки опухолевого происхождения или измененные клетки, приобретшие свойства опухолевых клеток.

В настоящее время метод культивирования клеток вне организма широко используется не только для цитологических, но и для генетических, вирусологических и биохимических исследований.

В культуре выращивают и растительные клетки. Для этого кусочки ткани обрабатываются ферментами, растворяющими клеточные оболочки. Отделившиеся клеточные тела, протопласты, помещают в культуральную среду, где они делятся и образуют зоны размножившихся клеток.

Наблюдения за живыми клетками регистрируют в виде фотографий, сделанных с помощью специальных фотонасадок к микроскопу. Живые клетки снимают и на кинопленку. А ускоренная или замедленная киносъемка (цейтраферная киносъемка) позволяет видеть протекание деления клеток, фагоцитоз, течение цитоплазмы, и т.д.

Сейчас с с помощью компьютерных технологий и специальных телекамер можно получать изображение клеток прямо на мониторе компьютера, записывать их, обрабатывать и получать в виде цветных или черно-белых отпечатков. Так же возможна цейтраферная съемка подвижных объектов.

При исследовании живых клеток используется микрохирургия, или оперативное воздействие на клетки. С помощью специального прибора микроманипулятора клетки разрезают, извлекают из них части, вводят вещества (микроинъекции) и т.д. Микроманипулятор совмещается с обычным микроскопом, в который наблюдают за ходом операции. Микрохирургическими инструментами служат стеклянные крючки, иглы, капилляры, которые имеют микроскопические размеры и изготовляются на специальных приспособлениях – «микрокузницах». При микроманипуляциях клетки помещают в специальные камеры, в которые вводят также инструменты. С помощью микрохирургических инструментов можно поворачивать в клетках митотические веретена, оттаскивать отдельные хромосомы, вводить в живую клетку меченые антитела или белковые молекулы. В последнее время в микрохирургии стали применять микропучки ультрафиолетового света или лазера. Это позволяет практически моментально инактивировать отдельные участки клетки. очень точно дозировать количество энергии в точке поражения и использовать очень короткие (наносекунды) импульсы облучения.

При изучении живых клеток используют витальные красители. Это красители кислой (трипановый синий, литиевый кармин) природы, применяемые при очень большом разведении (1 : 200000), для того, чтобы влияние красителя на жизнедеятельность клетки было минимальным. При окрашивании живых клеток краситель собирается в цитоплазме в виде гранул, а в поврежденных или мертвых клетках происходит диффузное окрашивание цитоплазмы и ядра.

Метод флуоресцентной микроскопии. При витальном изучении клеток используют флуоресцирующие красители и он основан на том, что ряд веществ обладают способностью светиться (флуоресцировать, люминесцировать) при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции всегда смещен в сторону больших длин волн по отношению к возбуждающему флуоресценцию излучению.

Собственной флуоресценцией обладают некоторые пигменты (хлорофиллы, бактериальные пигменты), витамины (А и В₂), гормоны. Если во флуоресцентный микроскоп рассматривать клетки растений, то на темно-синем фоне будут видны ярко светящиеся красные зерна внутри клетки – это хлоропласты.

В флуоресцентной микроскопии применяют флуорохромы (флуоресцирующие вещества), добавляя их живым клеткам. Этот способ аналогичен с витальным окрашиванием так как здесь также используют очень низкие концентрации красителя (1 х 10^-4–1 х 10^-5). Многие флуорохромы избирательно связываются с определенными структурами клетки, вызывая их вторичную люминесценцию. Например, флуорохром акридиновый оранжевый избирательно связывается с нуклеиновыми кислотами.

Разработан способ инъецирования в живые клетки меченых флуорохромами антител. Так, введенные в клетку меченные антитела к белку тубулину соединяются с микротрубочками, которые затем наблюдают в живых клетках с помощью флуоресцентного микроскопа.

В настоящее время широко используется для изучения живых клеток или их компонентов сочетание световой микроскопии (особенно фазовоконтрастной) с электроннно-компьютерной обработкой изображения. Данная методика позволяет на телеэкране видеть структуры, размер которых намного меньше разрешающей силы светового микроскопа.

Для того, чтобы получить трехмерную реконструкцию объекта разработан конфокальный сканирующий световой микроскоп. С помощью этого прибора получают серии последовательных оптических срезов, взятых с различной глубины и изображения которых накапливаются в компьютере, и по специальной программе реконструируется трехмерное, объемное, изображение объекта. Обычно используются объекты, окрашенные флуорохромами.