2.3.Изучение фиксированных клеток

В цитологии большая часть сведений о структуре и свойствах клеток получена на фиксированном материале. После повреждения клетки в ней происходит ряд изменений, а после смерти - активируются автолитические ферменты, что приводит к грубым изменениям клеточной структуры. Поэтому задача фиксации – убить клетку, остановить активность внутриклеточных ферментов и предотвратить распад клеточных компонентов. , а также избежать появлению структур, отсутствующих в живой клетке (артефактные структуры).

Для фиксации клеток используются альдегиды и их смеси с другими веществами. В качестве фиксаторов применяют также спирты, вызывающие необратимую денатурацию белков, осаждение нуклеиновых кислот и полисахаридов. Осаждающим действием обладают такие сулемовые фиксаторы и фиксаторы с пикриновой кислотой. Фиксаторы, содержащие четырехокись осмия (OsO₄), хорошо сохраняют липиды.

После фиксации материал подвергают дополнительной обработке. Главной из таких обработок является окрашивание клеток. Окрашивание клеток позволяет выявить в них массу деталей.

Стекла с фиксированными мазками одноклеточных организмов или с клетками культуры ткани непосредственно помещают в красители. Для окрашивания клеток в составе органов делают их срезы.

Для подготовки срезов после фиксации кусочки органов обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, спирт замещают ксилолом, а ксилол – парафином. Таким образом, фиксированная ткань, минуя высушивание на воздухе, оказывается заключенной в твердую массу парафина, которую можно нарезать.

Срезы толщиной до 5-10 мкм получают на специальном приборе – микротоме. Такие срезы приклеиваются на предметное стекло: парафин растворяется в ксилоле, ксилол удаляется спиртами, которые замещаются водой. Затем срезы окрашиваются водными растворами красителей. Для изготовления постоянных препаратов окрашенные срезы снова обезвоживаются и заливаются в канадский бальзам под покровным стеклом. Такие препараты можно длительно хранить.

Для окраски фиксированных тканей и клеток применяют различные натуральные и синтетические красители. Натуральные красители (гематоксилин, кармин и др.) употребляют в сочетании с протравами (окислы различных металлов), с которыми они образуют комплексные соединения (лаки).

Синтетические красители подразделяют на кислые и основные. Основные краски представляют собой соли красящих оснований, содержащие в своем составе аминогруппы, которые и определяют их щелочность. Такие красители образуют солевые связи с кислотными группами в структурах клетки. Следовательно, участки клеток, богатые кислотными группами, связываются с основными красителями и их называют, базофильными. Кислотные красители содержат в своем составе гидроксильные группы, или группы SO₂OH. Структуры клеток с основными (щелочными) свойствами связываются с кислотными красителями и их называют ацидо- или оксифильными. Существует множество смесей красителей, которые одновременно могут окрашивать различные участки клеток в разные цвета и тем самым повышать контрастность клеточных и внеклеточных компонентов. Используя всевозможные красители можно получить не только четкое изображение компонентов клетки, но и получить сведения о химизме той или иной клеточной структуры.

Метод гистохимических и цитохимических реакций. Метод основан на использовании специфических красочных приемов, прямо выявляющих те или иные вещества. Примером цитохимических реакций является широко применяемая реакция Фёльгена (реакция на ДНК). Суть ее заключается в том, что после специфического кислотного гидролиза только на ДНК в результате отщепления пуринов на дезоксирибозе образуются альдегидные группы. Эти группы взаимодействуют с реактивом Шиффа (обесцвеченное основание фуксина) и дают красное окрашивание в местах локализации ДНК. Например, специфическими реакциями на отдельные аминокислоты (тирозин, триптофан, аргинин и др.) можно определять локализацию белков. Липиды и жиры обнаруживают с помощью судана черного, хорошо растворяющегося и скапливающегося в жировых включениях.

С помощью цитохимических реакций обнаруживают ферменты. Принцип этих реакций состоит в том, что в микроскоп видны не сами белковые ферменты, а места их локализации, которые обнаруживаются по продуктам их специфической ферментативной активности.

Метод цитофотометрии. Основан на определении количества химических веществ по поглощению ими света определенной длины волны. Установлено, что интенсивность поглощения лучей пропорциональна концентрации вещества при одной и той же толщине объекта. На этом основании, оценивая степень поглощения света веществом, можно узнать его количество. Для цитофотометрических исследований разработаны цитофотометры – микроскопы, у которых за объективом расположен чувствительный фотометр, регистрирующий интенсивность прошедшего через объект светового потока. По площади или объему измеряемой структуры и значению поглощения, определяют как концентрацию исследуемого вещества, так и его абсолютное содержание. Метод широко используется при определении количества ДНК на клетку после реакции Фёльгена. В данном случае фотометрируется содержание красно окрашенного фуксина, количество которого прямо пропорционально содержанию ДНК. Полученные величины поглощения сравнивают со стандартами и получают точные значения количества ДНК, выраженные в граммах. Метод позволяет измерять количество ДНК до 10^-12 – 10^-14 г, в то время как микрохимические методы имеют чувствительность не более 10^-6 г.

Метод флуорометрии. К настоящему времени разработаны приемы количественной флуорометрии, позволяющие по степени свечения определить содержание веществ, с которыми связываются флуорохромы.

Для выявления специфически белков применяют иммунохимические реакции с использованием флуоресцирующих антител. Метод иммунофлуоресценции обладает очень большой специфичностью и чувствительностью. Сначала на белок получают специфическую сыворотку, содержащую антитела, антитела очищают и химически соединяют с флуорохромами. Затем препарат наливают на объекты и с помощью люминесцентного микроскопа по свечению флуорохрома находят места локализации искомых белков в клетке. Предварительно, чтобы меченые флуорохромами антитела проникли в клетку плазматическую мембрану делают проницаемой. Достигается это фиксацией клеток и частичной экстракцией липидов из мембран.

Метод радиоавтографии. Метод основан на регистрации веществ, меченых изотопами. При радиоавтографическом исследовании клеткам в среду вводится предшественник одного из макромолекулярных соединений (например, аминокислота или нуклеотид), один из атомов которого замещен радиоактивным изотопом. Например, вместо ¹²С введен атом ¹⁴С, вместо водорода – тритий ³Н и др. В процессе синтеза биополимера в него включается и меченая молекула. Регистрируют ее место в клетке с помощью фотоэмульсии.

С помощью этого метода было установлено, что вся РНК синтезируется только в интерфазном ядре а цитоплазматическая РНК является результатом миграции синтезированных молекул из ядра.

Метод молекулярной гибридизации. Используется для определения расположения определенных типов нуклеиновых кислот или отдельных нуклеотидных последовательностей в составе клеточных ядер или хромосом. Раствор с меченой нуклеиновой кислотой, например, с рибосомной РНК, наносят на препарат с денатурированной ДНК (разорваны водородные связи в нативной ДНК). В процессе ренатурации ДНК происходит образование молекулярного гибрида между меченой нуклеиновой кислотой из раствора и комплементарным ему участком ДНК в препарате. Место такой гибридизации определяется радиоавтографически. Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот позволяет с большой точностью локализовать на хромосоме места с данной нуклеотидной последовательностью или даже расположение определенных генов.

При молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот используется также окраска их флуорохромами. Благодаря этому можно в клетках локализовать любые последовательности ДНК и даже расположение в ядрах отдельных хромосом. Этот прием называется FISH-метод (флуоресцентная in situ гибридизация).