2.4.Электронная микроскопия

По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку.

Основная часть такого микроскопа представляет собой полый цилиндр (колонка микроскопа), из которого откачан воздух для того, чтобы не было взаимодействия электронов с молекулами газов и окисления вольфрамовой нити накаливания в катоде электронной пушки. Между катодом и анодом подается высокое напряжение (от 50 до 200-5000 кВ), что служит причиной ускорения электронов. В центре анода есть отверстие, проходя через которое электроны формируют пучок, идущий вниз по колонке микроскопа. Линзы электронного микроскопа представляют собой электромагниты, поле которых может изменять путь электронов (как стеклянные линзы изменяют путь фотонов). В конденсорной линзе пучок электронов фиксируется и попадает на объект, с которым электроны взаимодействуют, отклоняются, рассеиваются, поглощаются или проходят без изменения. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются объективной линзой, которая формирует увеличенное первичное изображение объекта. Так же как в световом микроскопе, объективная линза определяет его основные показатели. Первичное изображение увеличивается проекционной линзой и проецируется на экран, покрытый люминесцентным слоем, светящимся при попадании на него электронов. Вместо светящегося экрана изображение можно поместить на фотопластинку и получить снимок.

Напряжение, которое используется для ускорения электронов в большинстве просвечивающих (трансмиссионных) электронных микроскопов, достигает 50-150 кВ. При напряжении в 50 кВ электрон обладает длиной волны в 0,05 А, и в этом случае теоретически можно было бы получить разрешение в 0,025 А (d ~ 0,5 ). Однако в современных конструкциях электронных микроскопов достигается разрешение около 1 А (0,1 нм) из-за недостаточной стабильности напряжения, стабильности тока линз, неоднородности металла магнитных линз и других несовершенств прибора (теоретически возможно еще повысить разрешение электронного микроскопа в 100 раз). Но и достигнутое разрешение огромно (величина О-Н связи в молекуле воды равна 0,99 А): оно сейчас уже в 10⁶ раз выше разрешающей способности глаза!

На экранах и фотопластинках электронных микроскопов получают увеличение до 50 000 раз, затем при дальнейшей фотопечати можно получить еще 10-кратное увеличение. В итоге конечное увеличение, при котором максимально реализуется разрешение, достигает 10⁶_.

В настоящее время электронно-микроскопическое изображение с флуоресцирующего экрана с помощью цифровой телекамеры может передаваться прямо в компьютер, где на экране монитора его обрабатывают различным образом (изменяют увеличение, контрастность изображения, проводят морфометрию отдельных компонентов и т.д.).

В настоящее время максимальное разрешение электронного микроскопа (ЭМ) реализуется только при исследовании металлов или кристаллических решеток. На биологических объектах такого разрешения получить пока не удается из-за низкой контрастности объекта. Биологические объекты для исследования в ЭМ помещаются на медные сеточки, покрытые тонкими пленками – подложками (формвар, коллодий, углерод), состоящими в основном из углерода. Минимальная толщина биологического объекта с плотностью около 1 г/см³, выявляемого при ускоряющем напряжении в электронном микроскопе 50 кВ, равна 50 А. Вирусы, расположенные на поддерживающей пленке, видны в этом случае в виде бесструктурных пятен, а молекулы нуклеиновых кислот (толщина ДНК равна 20 А) вообще не видны из-за низкого контраста. Контраст биологических объектов повышают, используя тяжелые металлы или их соли.

Ультрамикротомия. При прохождении пучка электронов через биологический объект часть электронов поглощается, что приводит к нагреванию объекта и к его деформации. В этой связи требуется готовить очень тонкие объекты (не выше 0,1 мкм). Процедура их изготовления сходна с той, что используется в световой микроскопии. Клетки и ткани для этого сначала фиксируют. В качестве фиксаторов используются буферные растворы глутарового альдегида или четырехокиси осмия. Применяется двойная фиксация: сначала глутаровым альдегидом, а затем осмием, который как тяжелый металл контрастирует клеточные структуры. Затем, после обезвоживания, ткани пропитываются эпоксидными смолами или другими пластиками в жидкой, мономерной форме. При полимеризации таких пластмасс пропитанный ими объект оказывается заключенным в твердые блоки, которые уже можно резать на тонкие срезы. Тонкие срезы готовятся с помощью использования специальных приборов – ультрамикротомов. Площадь получаемых ультратонких срезов обычно очень мала (0,1-1 мм²), поэтому все операции при ультрамикротомировании идут под микроскопическим контролем. Срезы, смонтированные на сетках с подложкой, дополнительно контрастируют – «окрашивают» с помощью солей тяжелых металлов. Для этого используют соли свинца и урана, которые связываясь с внутриклеточными структурами на срезе, позитивно их контрастируют.

Этот метод позволяет применять цитохимические приемы на уровне электронной микроскопии.

В электронно-микроскопических исследованиях возможно применение радиоавтографии. В этом случае используются сверхтонкозернистые эмульсии (величина гранул около 0,02-0,06 мкм).

Все большее применение получают методы криоультрамикротомии, т.е. получение срезов с замороженных тканей, моментально охлажденных до температуры жидкого азота (-196^оС). При этом происходит практически одномоментное торможение всех метаболических процессов, а вода из жидкой фазы переходит в твердую, но не кристаллическую, ее молекулярная структура беспорядочна (стекловидное состояние). Такие твердые блоки при температуре жидкого азота можно резать на ультратонкие срезы.

Во время проведения иммунохимических исследований используют антитела, связанные с частицами коллоидного золота, локализованного на препаратах и указывающего места расположения искомого антигена.

Метод замораживания–скалывания. Используется для изучения структуры различных мембранных компонентов клетки. Метод основан на том, что объект сначала быстро замораживают жидким азотом, а затем при той же температуре переносят в специальную вакуумную установку. Там замороженный объект механическим способом скалывается охлажденным ножом. При этом обнажаются внутренние зоны замороженных клеток. В вакууме часть воды, перешедшей в стекловидную форму, возгоняется («травление»), а поверхность скола последовательно покрывается тонким слоем испаренного углерода, а затем металла. С замороженного и сохраняющего прижизненную структуру материала получают реплику скола. Затем уже в условиях комнатной температуры ткань или клетки растворяют в кислотах, но пленка-реплика при этом остается цела, ее изучают в электронном микроскопе. Данный метод позволил увидеть, что как на поверхности, так и в толщине клеточных мембран располагаются глобулы интегральных белков, что мембраны не однородны по своей структуре.

Метод контрастирования корпускулярных объектов. . Корпускулярными объектами называют частички вирусов, фагов, выделенные клеточные компоненты (рибосомы, мембраны, вакуоли и т.д.), макромолекулы.

Широко распространенным методом контрастирования биологических объектов является оттенение металлами. Проводят его следующим образом. В специальных вакуумных установках производится термическое испарение металла при котором атомы металла разлетаются от места испарения по прямым траекториям. Встречаясь с биологическим объектом, они осаждаются на нем в виде слоя; его толщина больше в местах, перпендикулярных направлению полета частиц металла. В участках, где объект экранирует пучок частиц, возникнут «тени». Следовательно, напыленная часть объекта имеет большую плотность, чем напыленная подложка (фон), и поэтому объект виден. Метод широко применяется не только для контрастирования вирусов, рибосом, но и для достаточно тонких молекул нуклеиновых кислот. Для контрастирования используются платина, палладий, их сплавы, уран.

При негативном контрастировании объектов растворами солей тяжелых металлов применяют молибденовокислый аммоний, уранилацетат, фосфорно-вольфрамовую кислоту (ФВК). Водные растворы таких веществ смешивают с биологическими объектами, а затем их наносят на пленки-подложки и высушивают. После этого объекты (например, вирусы) оказываются как бы погруженными в тонкий слой аморфного вещества высокой плотности. В электронном микроскопе они выглядят как светлые объекты на темном фоне (как фотонегатив). Преимущества метода заключаются в том, что растворенные соли могут проникать вглубь объекта и выявлять дополнительные его детали. Негативное контрастирование широко применяется при изучении вирусов, ферментных комплексов мембран. Соли тяжелых металлов используют при позитивном контрастировании. В этом случае контрастирующее вещество связывается со структурой, повышает ее электронную плотность. Часто для позитивного контрастирования нуклеиновых кислот используют растворы уранилацетата в спирте или в ацетоне.

Метод высоковольтной микроскопии. В настоящее время изготовлены приборы с ускоряющим напряжением 1-3 млн. вольт. Преимущество высоковольтных электронных микроскопов заключается в том, что на них можно получить не только более высокое разрешение, но и просматривать образцы большой толщины (1-10 мкм). Одновременно с высоковольтной микроскопией использование стереоскопической съемки позволяет получать информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высоким их разрешением (около 0,5 нм).

Метод сканирующей (растровой) электронной микроскопии. Данный метод даёт трехмерную картину поверхности клетки. При сканирующей электронной микроскопии пучок электронов (зонд) пробегает по поверхности объекта, и полученная информация передается на электронно-лучевую трубку.

С помощью растровой электронной микроскопии можно получить информацию о химическом составе в тех или иных участках клеток. Например, метод рентгеноспектрального микроанализа основан на идентификации и количественной оценке содержания химических элементов по спектрам характеристического рентгеновского излучения, возникающего при взаимодействии первичных электронов с атомами объекта.

2.5.Специальные методы

Фракционирование клеток. В настоящее время фракционирование позволяет получать практически любые клеточные органеллы и структуры: ядра, ядрышки, хроматин, ядерные оболочки, плазматическую мембрану, вакуоли эндоплазматического ретикулума, и т.д.

Перед получением клеточных фракций клетки разрушают путем гомогенизации. Затем из гомогенатов выделяют фракции. Основным способом выделения клеточных структур является разделительное центрифугирование. Оно основано на том, что более тяжелые частицы быстрее оседают на дно центрифужной пробирки.

При небольших ускорениях (1-3 тыс. g) раньше оседают ядра и неразрушенные клетки, при 15-30 тыс. g оседают более крупные частицы или маакросомы, состоящие из митохондрий, мелких пластид, пероксисом, лизосом и др., при 50 тыс. g оседают микросомы, фрагменты вакуолярной системы клетки. При повторном центрифугировании смешанных подфракций выделяют чистые фракции. Для более тонкого разделения фракций используют центрифугирование в градиенте плотности сахарозы. Получение отдельных клеточных компонентов позволяет изучать их биохимию и функциональные особенности, создавать бесклеточные системы, например, для рибосом, которые могут синтезировать белок по заданной экспериментатором информационной РНК, или для воссоздания клеточных надмолекулярных структур. Такие искусственные системы помогают изучать тонкие процессы, протекающие в клетке.

Метод клеточной инженерии. После специальной обработки различные живые клетки могут сливаться друг с другом и образовывать двуядерную клетку или гетерокарион. Гетерокарионы, особенно образованные из близкородственных клеток (например, мыши и хомячки), могут вступать в митоз и давать истинно гибридные клетки. Другие приемы позволяют конструировать клетки из разных по происхождению ядер и цитоплазмы.

В настоящее время клеточная инженерия широко применяются не только в экспериментальной биологии, но и в биотехнологии. Например, при получении моноклональных антител.