5. Изучение вирусов животных и человека

После того как Д. И. Ивановский установил способность ВТМ проходить через фильтры, задерживающие бактерии, началось изучение в том же плане возбудителей различных болезней животных и человека. Уже в 1898 г. Ф. Лефлер и П. Фрош сообщили о фильтруемости вируса ящура.

В течение нескольких последующих лет была установлена фильтруемость возбудителей чумы кур, желтой лихорадки и чумы свиней.

Поскольку большинство вирусов увидеть при помощи светового микроскопа нельзя, усилия ученых на первых этапах были направлены на изучение более крупных образований, которые формируют некоторые вирусы в пораженных клетках. Подобные включения были описаны еще и XIX в. при контагиозном моллюске человека, при оспе птиц и оспе человека (Г. Гварниери). В 1903 г. А. Негри описал своеобразные тельца, выявляемые в протоплазме нервных клеток при бешенстве. В 1921 г. Б. Липшютц классифицировал вирусные включения по их местоположению в ядре или цитоплазме клетки. Вирусы оспы и бешенства, например, формируют включения в цитоплазме, аденовирусы и герпетические вирусы — в ядре, а вирус кори — в ядре и цитоплазме. Было установлено, что включения различаются и по своей структуре. Они могут представлять собой места синтеза вирусных компонентов, агрегаты вирусных частиц или являться следствием нарушенного клеточного обмена.

Впервые непосредственно вирусные частицы удалось увидеть Дж. Буисту в 1887 г. при исследовании материала от оспенного больного; возбудитель оспы относится к наиболее крупным вирусам, размеры которого находятся на границе разрешающей способности светового микроскопа.

До 1931 г. выделение и культивирование вирусов человека и живот­ных осуществлялось почти исключительно путем заражения восприим­чивых животных. Имелись отдельные успешные попытки размножении вирусов в клеточных культурах (осповакцины, ящура), однако ввиду сложности техники они не нашли широкого применении.

Путем заражения животных были выделены и изучены возбуди­тели оспы, бешенства, простого герпеса, гриппа, полиомиелита, лимфоцитарного хориоменингита, желтой лихорадки, ряда клещевых и комариных энцефалитов, энцефаломиелитов лошадей и некоторые другие. Однако этот метод не позволял получать вирус в больших количествах, необходимых для его детального изучения; к тому же большие трудно­сти представляла очистка материала от тканевых фрагментов. Кроме того, далеко не все вирусные инфекции удавалось воспроизвести на лаборатор­ных животных.

Толчком для дальнейшего развития вирусологии послужило открытие в 1931 г. Эрнстом Гудпасчером возможности культивировать вирус оспы кур в развивающемся курином эмбрионе. Было установлено, что очень многие вирусы хорошо размножаются в этих условиях, накапливаясь в хорионаллантоисной оболочке и жидкостях эмбриона. Очистка вируса от аллантоисной жидкости оказалась сравнительно простой. К тому же у некоторых вирусов (например, у ряда представителей оспенной группы) была обнаружена способность вызывать на хорионаллантоисной оболочке очаговые поражения, по числу которых можно весьма точно определить титр вируса.

В 1941 г. Г. Херст обнаружил у вируса гриппа способность склеивать эритроциты кур. В дальнейшем у многих вирусов была установлена способность агглютинировать эритроциты тех или иных млекопитающих и птиц. Это дало в руки вирусологов простой метод количественного опре­деления многих вирусов и соответствующих антител.

В 30-е годы были разработаны новые методы исследования вирусов. В 1939 г. М. фон Арденн и X. Руска предложили метод электронно-микроскопического исследования вирусных частиц, находящихся во взве­си. Позже была разработана методика получения ультратонких тканевых срезов, позволяющая электронномикроскопически выявлять вирусы внутри пораженных клеток. Для получения концентрированных вирусных суспензий стали использовать ультрацентрифугирование. Путем измерения скорости осаждения различных вирусов оказа­лось возможным определить их размеры и вес. В 1933 г. У. Элфорд предложил использовать для определения размеров вирусов коллодийные мембраны с различной величиной пор. После получения ВТМ в кристал­лическом виде было установлено, что формировать кристаллические струк­туры могут и некоторые мелкие вирусы позвоночных, например вирус полиомиелита.

Совершенно исключительное значение для развития вирусологии име­ла предложенная в 1948 г. Джоном Эндерсом с сотрудниками методика получения однослойных клеточных культур из обработанных трипсином тканей с добавлением пенициллина для ингибирования роста бактерий. Она позволяет выращивать практически любые типы клеток. Выращенные в культуре клетки нередко обладают значительно более широким спектром восприимчивости по отношению к различным вирусам, чем те же клетки в организме. При инокуляции достаточной дозы вируса оказалось возможным инфицировать одновременно все клет­ки однослойной культуры. Это позволило получать вирус в высоком титре, к тому же с небольшой примесью клеточных белков. Большин­ство вирусов при развитии в однослойных культурах вызывает дегене­рацию клеток («цитопатический эффект»). Это явление стали широко использовать для титрования вирусов и антител.

Р. Дюльбекко и М. Фогт (1952) разработали на основе однослойных клеточных культур методику получения под слоем агара или другого геля колоний вируса (бляшек), образующихся из одной инфекционной вирусной частицы. Метод позволил производить точный подсчет количе­ства инфекционных вирусных частиц, а также выделять отдельные клоны вируса, что необходимо при генетических и иных исследованиях.

Размеры вирусов животных и человека находятся в пределах от 300 нм (оспенные вирусы) до 18—22 нм (аденоассоциированные). Использование электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа в сочетании с рядом других методов позволило расшифровать структуру большинства вирусов. Начало этим исследованиям положили Ф. Крик и Дж. Уотсон в 1956 г. Было установлено, что все вирусы человека и животных состоят из ядра, содержащего один тип нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК, и протеиновой оболочки (капсида). Вместе обе эти структуры носят название нуклеокапсида. Капсид любого вируса построен из структурных субъединиц, каждая из которых представляет одну или несколько полипептидных цепей. Существует два типа организации субъединиц — спиральный и кубический. У некоторых крупных вирусов (например, оспенных) могут комбинироваться оба способа соединения субъединиц. При спиральной структуре нуклеокапсид имеет форму тяжа (например, у вируса гриппа), а при кубической — правильного многогранника (например, у аденовирусов).

Мелкие вирусы (например, вирус полиомиелита) представляют собой «голый» нуклеокапсид. Более крупные вирусы (герпетические, миксовирусы) имеют еще внешнюю оболочку, которая у ряда вирусов состоит в основном из материала клетки и содержит протеины, углеводы и иногда липоиды.

Большинство РНК-содержащих вирусов животных и человека содержит одну молекулу одноцепочечной РНК. Исключение составляют реовирусы и группа арбовирусов, у которых РНК состоит из двух комплементарных цепей. У большинства ДНК-содержащих вирусов нуклеиновая кислота представляет собой двухцепочечную молекулу и только одна группа ви­русов (парвовирусы) имеют одноцепочечную ДНК. Величина информа­ции, заключенной в нуклеиновой кислоте разных вирусов, различна и зависит от длины тяжа нуклеиновой кислоты. Мелкие вирусы могут синтезировать небольшое число протеинов, более сложные — помимо структурных протеинов еще ферменты. Некоторые вирусы (например, адено-ассоциированные) обладают недостаточной информа­цией даже для собственного воспроизводства: для своего размножепия они нуждаются в аденовирусе-помощнике.

Для изучения процессов репликации вирусов животных и человека и взаимодействия их с клетками большое значение имел разработанный А. Кунсом (1941) метод окраски вирусных антител флюорохромами, на­пример флюоресцеин-изотиоцианатом, который позволяет изучать при по­мощи люминесцентной микроскопии динамику накопления вирусных бел­ков в клетке. На том же принципе основано использование конъюгиро-ванных с ферритином или пероксидазой антител, когда вирусные анти­тела в клетке выявляют при помощи электронной микроскопии.

Адсорбция вирусов животных на клетках происходит в результате дей­ствия электростатических сил, межмолекулярных сил Ван-дер-Ваальса, а также взаимодействия соответствующих друг другу рецепторов вируса и лигандов клетки. Есть вирусы (например, пикорнавирусы), адсорбирующиеся только на восприимчивых клетках; другие (оспенные и аденовирусы) могут соединяться как с восприимчивыми, так и невосприимчивыми клетками. Некоторые клетки, не обладающие рецепторами для взаимо­действия с какими-либо вирусами in vivo, приобретают их при культи­вировании in vitro (почечные клетки приматов к вирусу полиомиелита).

В отличие от бактериофагов, вирусы животных не обладают каким-либо сложным аппаратом для введения в клетку своей нуклеиновой кислоты; они просто фагоцитируются клеткой. Некоторые вирусы (на­пример, полиомиелита) уже при адсорбции на клетке теряют свой кап­сид. Другие (герпетические и оспенные вирусы, миксо- и аденовирусы) проникают в клетку в виде цельных вирионов, и уже там нуклеиновая кислота освобождается из капсида.

Было выяснено, что процесс репликации отдельных вирусов человека и животных имеет определенные особенности, однако у всех она проте­кает по общей принципиальной схеме. Репликация начинается с синтеза «ранних протеинов», которые служат для репликации нуклеиновой кис­лоты, но не включаются в вирусные частицы. Лишь после этого начи­нается процесс репликации самой нуклеиновой кислоты.

Что касается процесса синтеза структурных белков, входящих в со­став вируса, то оказалось, что он протекает несколько отлично у ДНК- и РНК-содержащих вирусов. У первых на од­ной из цепей ДНК после их расхождения синтезируется информационная РНК, передаю­щая информацию от ДНК клеточным рибосомам, где происходит синтез вирусных белков. У РНК-содержащих вирусов функция передачи инфор­мации принадлежит самой вирусной РНК.

Места синтеза вирусных компонентов в клетке у разных вирусов раз­личны. У оспенных вирусов весь процесс протекает в цитоплазме, у аде­новирусов — в ядре, в то время как ДНК герпетических вирусов синте­зируется в ядре, а структурные белки в цитоплазме. Созревание всех вирусов, т. е. соединение нуклеиновой кислоты и белков, происходит в цитоплазме по типу самосборки.

Внешнюю оболочку вирусы приобретают при прохождении через раз­личные клеточные мембраны. Свернутый в клубок нитевидный нуклеокапсид вируса гриппа и других микровирусов облекается оболочкой в мо­мент прохождения через оболочку клетки. Герпетические вирусы приоб­ретают оболочки при прохождении как сквозь ядерные, так и цитоплаз-матические мембраны.

Были описаны различные формы взаимодействия вирусных частиц, на­ходящихся в одной клетке. Г. Берри и X. Дедрик (1936) наблюдали реак­тивацию гретого вируса миксомы, если его вводили кролику одновременно с инфекционным вирусом фибромы. Позже было установлено, что в этом случае активный вирус освобождает нуклеиновую кислоту гретого вируса из капсида, вследствие чего она приобретает способность функциониро­вать. При генетической форме реактивации соединяются два или более поврежденных геномов одного вируса.

В 1956 г. Г. Херст и Т. Готлиб наблюдали рекомбинацию двух гриппозных штаммов с появ­лением генетически стойких вариантов со свойствами обоих родителей. В 1964 г. обнаружили даже образование гибридов между неродственными вирусами — аденовирусом человека и вакуолизирующим вирусом обезьян.

Особый интерес представляют онкогенные вирусы. Как уже отмечалось, в 1911 г. П. Раус перевил саркому кур бесклеточным фильтратом. В 1936 г. Дж. Битнер открыл вирус рака молочных желез мышей. Затем была обнаружена способность вызывать трансформацию клеток in vitro у ДНК-содержащих онкогенных виру­сов — полиомы, SV40 обезьян, аденовирусов.

Все онкогенные РНК-содержащие вирусы относятся к одной группе - лейковирусам, в то время как ДНК-содержащие — к различным груп­пам - оспенным вирусам, паповавирусам, аденовирусам и герпетическим. Общим свойством обеих групп является способность интегрировать свой геном в геном клетки, вследствие чего она приобретает способность к неограни­ченному росту. Эта концепция была выдвинута Р. Дюльбекко (I960) и Л. А. Зильбером (1961). Было установлено, что трансформированные ДНК-содержащими вирусами клетки содержат часть вирусного генома, синтезируют вирусспецифический антиген, но не продуцируют вирусных частиц (исключение составляют оспенные виру­сы).

В отношении РНК-содержащих вирусов X. Темин в 1964 г. показал, что они включают в клеточный геном не РНК, а вновь образованную комплементарную двуспиральную ДНК. У всех лейковирусов был обнаружен необходимый для этого фермент — РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) (Г. Темин, С. Мицетани, 1970). Следует отметить, что большинство онкогенных виру­сов могут функционировать и как инфекционные, вызывая дегенерацию клеток.

Одной из реакций клетки на внедрение вируса является выработка резистентности к заражению другим вирусом (явление интерференции). В 1935 г. М. Хоскинс сообщил о взаимном подавляющем действии ней-ропного и висцеротропного штаммов вируса лихорадки в опытах на обезья­нах, а Ф. Маграсси — двух различных штаммов вируса герпеса простого при введении кроликам. Вскоре интерференция была выявлена и между неродственными вирусами, если опыты ставились с куриными эмбрио­нами или клеточными культурами. Далее было установлено, что рези­стентность клетки может вызвать не только живой, но и инактивированный вирус. В большинстве случаев интерференция оказалась связан­ной с синтезом клеткой особого белка — интерферона, открытого А. Айзаксом и Дж. Линденманном в 1957 г. Интерферон обусловливает невоспри­имчивость клетки к различным вирусам и отличается видоспецифичностью (так, куриный интерферон защищает только куриные клетки).

Надежды использовать интерферон для лечения вирусных заболева­ний не оправдались, хотя он и может применяться как профилактиче­ское средство. Большее значение имеет стимуляция синтеза организмом собственного интерферона; индукторами могут служить определенные хи­мические соединения, например двутяжевые РНК.

Наиболее эффективным методом борьбы с вирусными инфекциями остается активная иммунизация. Предложенная Э. Дженнером в 1796 г. вакцина против оспы является одним из лучших противовирусных препа­ратов. Занимаясь практической вра­чебной деятельностью, англичанин Эдуард Дженнер (1749—1823) изучал известные в народной медицине предохранительные свойства коровьей оспы: люди, переболевшие ею, становятся иммунными как к коро­вьей, так и к человеческой оспе. После долгих и тща­тельных наблюдений 14 мая 1796 г. Дженнер впервые провел прививку коровьей оспы восьмилетнему маль­чику, использовав материал, взятый от женщины (доярки), бо­левшей коровьей оспой. Прививка сопровождалась не­домоганием. А два месяца спустя мальчик был инфи­цирован гноем из пустулы больного натуральной ос­пой— и остался здоровым. В 1798 г., после много­кратного повторения этого опыта, Дженнер опублико­вал результаты своей работы. Он предложил назвать новый метод вакцинацией (от латинского vaccinia — коровья оспа).

Страх перед оспой был так велик, что метод Дженнера приняли с восторгом, а сопротивление наиболее консервативных было быстро сломлено. Вакцинация распространилась по всей Европе, и болезнь отсту­пила. В странах с высокоразвитой медициной врачи уже не чувствовали себя беспомощными в борьбе с оспой. В истории человечества это был первый слу­чай быстрой и радикальной победы над опасной бо­лезнью.

Задолго до открытия вирусов была также разработана Л. Пастером вакцина против бешенства. Очень эффективным препаратом оказалась вакцина против желтой лихорадки, разработанная в 30-е годы XX в. Все эти вакцины готовятся из живых ослабленных штаммов вируса.

Вакцина против желтой лихорадки была получена в 30-е годы южноафриканским микро­биологом Максом Тейлером после длительных внутримозговых пассажей (серии после­довательных заражений) вируса, сначала на обезья­нах, а затем на белых мышах. У мышей вирус желтой лихорадки вызывал энцефалит — воспаление головно­го мозга. После длительного пассирования вируса на мышах Тейлер вновь привил его обезьянам. К этому времени вирус был уже ослаблен, и обезьяны стра­дали лишь очень слабыми приступами желтой лихо­радки. Но у животных вырабатывалась полная невос­приимчивость к большинству вирулентных штаммов вируса.

В 1936 г. Тейлер создал еще более безвредную вакцину против желтой лихорадки, отобрав ослабленный вирусный штамм из штаммов, длительно пассированных (до 200 раз) в культуре ткани куриного эмбриона.

Вирус по­лиомиелита был выделен в 1908 г. Ландштейнером, впервые заразившим этой болезнью обезьян. Однако обезьяны — малопригодный объект для поисков ос­лабленного штамма из-за дороговизны и трудности со­держания большого числа животных.

Американский микробиолог Джон Эндерс с двумя молодыми помощниками, Томасом Веллером и Фреде­риком Роббинсом, в 1948 г. попытался культивировать вирусы в однослойной культуре клеток куриных эмбрионов, обработанных трипсином. Подобные по­пытки делались и раньше, но всегда оканчивались не­удачей, поскольку культура вируса вытеснялась быстро размножающимися бактериями. Однако Эндерс доба­вил к среде открытый незадолго до этого пенициллин. Последний приостанавливал рост бактерий, никак не влияя на вирус. Вначале Эндерсу удалось успешно культивировать вирус паротита, а затем вирус полио­миелита (1949). Появилась возможность выращивать вирус полиомиелита в достаточном количестве, а зна­чит, и надежда напасть среди сотен штаммов на ос­лабленный с желательными свойствами. Американ­ский микробиолог Альберт Сейбин успешно селекционировал и очистил в 1957 г. три типа ослабленных вакцинных штаммов для каж­дого из трех разновидностей полиомиелита и создал эффективную живую вакцину.

Эта вакцина сыграла важнейшую роль в борьбе с полиомиелитом. Массовое распространение получила также живая вакцина против кори. Очень сложно оказалось создать эффективную вакцину против гриппа вследствие ускоренной изменчи­вости циркулирующих в природе вирусов гриппа («антигенный дрейф»).

Химиотерапия вирусных инфекций достигла определённых успехов, особенно при использовании с профилактической целью. При оспенном и герпетическом поражении роговицы используют 2-иод-2'-дезоксиуридин, блокирующий синтез вирусной ДНК. Метисазон оказался весьма эффективным в отношении оспенной инфекции, подавляя синтез структурных белков вируса. Ингавирин эффективен для профилактики и лечения гриппа и ОРВИ.