16. Детоксиксикационная функция печени. Разновидности механизмов. Роль цитохрома р-450

Термин детоксикация относится к целому ряду гоместатических функций печени , поддерживающих постоянство состава крови . Бактерии и другие патогенные организмы удаляются из крови синусоидов купферовскими клетками , а токсины, которые они выделяют, обезвреживаются в результате биохимических реакций, происходящих в гепатоцитах ( клетках печени ). К обезвреживанию токсинов приводят такие реакции, как окисление, восстановление, метилирование или конденсация с другой органической или неорганической молекулой. После детоксикации эти вещества, теперь уже в виде безвредных продуктов, выводятся почками .Водорастворимые вещества обычно выводятся в неизмененном виде с мочой или желчью. Жирорастворимые же соединения должны превращаться в менее активные или водорастворимые вещества, в противном случае они могут накапливаться в организме и влиять на его жизнедеятельность. Печень обеспечивает элиминацию многих экзо- и эндогенных соединений. Интенсивность элиминации того или иного соединения зависит от связывания его с белками, активности в его отношении печеночных ферментов и печеночного кровотока. Элиминация ряда веществ в значительной степени происходит уже при первом прохождении через печень крови, оттекающей от ЖКТ через воротную вену.Существуют два основных способа биотрансформации различных веществ в печени.Первый из них заключается в химической модификации активного участка вещества путем окисления, восстановления, гидроксилирования, сульфоокисления, дезаминирования, деалкилирования или метилирования. В этих процессах участвуют микросомальные ферменты (монооксигеназы, связанные с цитохромом Р450 и b5), цитоплазматические глутатионтрансферазы и т. д. В результате этих биохимических реакций обычно происходит инактивация лекарственных веществ (например, бензодиазепинов ). Однако некоторые метаболиты бывают активными (например, метаболит кортизона кортизол , преднизона - преднизолон , имипрамина - дезипрамин ), а иногда - токсичными (например, метаболиты изониазида и парацетамола ).В печени могут, с одной стороны, образовываться высококанцерогенные эпоксидные соединения, с другой - обезвреживаться многие канцерогены .Некоторые вещества ( барбитураты , галоперидол , глутетимид ) индуцируют микросомальные ферменты печени , особенно цитохром Р450 ; другие вещества ( хлорамфеникол , циметидин , дисульфирам , декстропропоксифен , аллопуринол ) ингибируют их. Этанол может оказывать оба эффекта. Одновременный прием двух препаратов, метаболизируемых одними и теми же микросомальными ферментами, может привести к усилению или ослаблению фармакологического действия одного из них или обоих.Активность ферментов, участвующих в данных реакциях, зависит от возраста.Второй способ печеночной элиминации - это перевод жирорастворимых веществ в водорастворимые (глюкурониды, сульфаты, ацетильные, тауриновые и глициновые производные), которые затем выводятся с мочой или желчью. Наиболее часто происходит реакция конъюгации с глюкуроновой кислотой , катализируемая глюкуронилтрансферазами. Как правило, конъюгированные формы более водорастворимы и менее активны, чем исходные.При хронических заболеваниях печени в различной степени изменяются захват, метаболизм и элиминация ряда лекарственных средств. При портокавальном шунтировании снижается элиминация при первом прохождении через печень некоторых препаратов, принимаемых внутрь. Изменение архитектуры печени и нарушение внутрипеченочной гемодинамики при циррозе печени также могут привести к снижению элиминации лекарственных веществ. При гипоальбуминемии возрастает доля свободной фракции препаратов, связывающихся с альбумином, а вследствие этого - их активность.Снижение активности микросомальных ферментов может привести к замедлению инактивации и элиминации противосудорожных ( фенитоин , фенобарбитал ) и противовоспалительных ( парацетамол , фенилбутазон , глюкокортикоиды ) средств, транквилизаторов , кардиотропных средств ( лидокаин , хинидин , пропранолол ), антибиотиков ( нафциллин , хлорамфеникол , тетрациклины , клиндамицин , триметоприм , рифампицин , пиразинамид ) и многих других препаратов. Это ведет к снижению терапевтической дозы и терапевтического диапазона.У больных с хроническими заболеваниями печени могут изменяться не только фармакокинетические свойства, но и активность лекарственных средств - так, возрастает чувствительность ЦНС к наркотическим анальгетикам и транквилизаторам.При острых и хронических заболеваниях печени иногда бывает очень трудно подобрать лечение. Так, бензодиазепины в подобных случаях нередко вызывают печеночную кому. При этом часто бывает очень нелегко понять, чем вызваны возбуждение , спутанность сознания и изменения поведения - ранней стадией печеночной энцефалопатии или бензодиазепинами , наркотическими анальгетиками , барбитуратами и т. д. Необходимо учитывать, что клиренс лекарственных средств у больных с поражением печени может быть самым различным, и поэтому дозы следует подбирать индивидуально, ориентируясь на сывороточную концентрацию препарата.Механизмы, ответственные за элиминацию лекарственных веществ, могут привести и к образованию гепатотоксичных соединений. Например, парацетамол метаболизируется микросомальными ферментами печени . При этом в качестве метаболита образуется сильнодействующий свободный радикал (предположительно N-ацетилимидохинон ), который может необратимо инактивировать многие ферменты и другие белки, связываясь с их сульфгадрильными группами. В норме токсическое действие этого радикала предотвращается реакцией с восстановленным глутатионом . Однако при передозировке парацетамола или поражении печени запасы глутатиона в гепатоцитах быстро истощаются, и избыток метаболита может привести к инактивации клеточных белков и обширному некрозу гепатоцитов. При передозировке парацетамола необходимо быстро ввести ацетилцистеин - вещество, богатое сульфгидрильными группами.Р450 играют важную роль в окислении многочисленных соединений, как эндогенных (стероиды, желчные кислоты, жирные кислоты, проста- гландины, лейкотриены, биогенные амины), так и экзогенных (лекарства, яды, продукты промышленного загрязнения, пестициды, канцерогены, мутагены и т.п.), последние называют ксенобиотиками.По типу катализируемых реакций Р450 можно отнести к монооксигеназам внешнего типа. В присутствии доноров электронов (NAD(P)H) Р450 способен активировать молекулярный кислород, один атом которого затем внедряется в молекулу окисляемого субстрата, а другой восстанавливается до воды'

R + AH + O L ROH + A + H O где R - субстрат, ROH - продукт, AH - донор электронов.

Оксигеназные реакции, катализируемые цитохромом Р450, весьма разнообразны. Одна из наиболее широко распространенных реакций окисления ксенобиотиков - реакция окислительного деалкилирования, которая сопровождается окислением алкильной группы, присоединенной к N-, O- или S-атомам. Второе место по распространенности принадлежит реакциям гидроксилирования циклических соединений, которые включают гидроксилирование ароматических, предельных и гетероциклических углеводородов. Р450 может также катализировать реакции гидроксилирования алифатических соединений, N-окисление, окислительное дезаминирование, реакции восстановления азо- и нитросоединений. Реакции окисления природных соединений включают w-окисление насыщенных жирных кислот, гидроксилирование стероидных гормонов, желчных кислот и холестерина, биосинтез простагландинов, перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот.

В отличие от других гемопротеинов, обладающих как правило в клетке лишь одной активностью и строго определенной функцией, Р450 наряду с монооксигеназной может проявлять и оксидазную активность, генерируя активные формы кислорода в виде суперокисного и гидрок- сильного радикалов, перекиси водорода. В связи с этим в литературе иногда Р450 называют оксидазой со смешанной функцией. А.И. Арчаков с сотр. обнаружили, что Р450 может функционировать и как истинная четырехэлектронная оксидаза, генерируя только воду из молекулы кисло рода. Р450 обнаруживает и пероксидазную активность, используя в реакции окисления в качестве косубстратов, вместо NAD(P)H, органи- ческие перекиси или перекись водорода. Имеются данные, что Р450 может катализировать диоксигеназные реакции. Таким образом, характер- ной особенностью Р450 является множественность функций, но основной является монооксигеназная. На рис. 1.32 представлена общая схема оксигеназной и оксидазных реакций. На 1-ой стадии оксигеназного цикла (цикл а) происходит связывание субстратов с окисленной формой Р450 с образованием фермент-субстратных комплексов. При этом в зависимости от субстратов могут появляться три типа спектральных из- менений: I, II и модифицированный II, характеризующиеся в дифференциальном спектре поглощения максимумом и минимумом при определенных длинах волн. Субстраты I типа взаимодействуют в основном с низко- спиновой формой Р450 и атом железа из шестикоординированного низко- спинового состояния переходит в пятикоординированное высокоспиновое состояние. В образовании комплексов I типа ведущую роль играют гидрофобные взаимодействия неполярных субстратов с активным центром фермента. Комплексы типа II возникают в результате взаимодействия аминогруппы субстрата с атомом железа гема, находящимся либо в вы- сокоспиновом, либо в низкоспиновом состояниях. При этом высокоспиновая форма железа переходит в низкоспиновую. Железо гема в таких комплексах находится в шестикоординированном состоянии, причем ме- сто связывания кислорода занято азотом субстрата. Модифицированный тип II спектральных изменений является результатом взаимодействия гидроксильной группы субстрата с высокоспиновой формой железа. Ско- рость взаимодействия субстратов I типа с Р450, как правило, на по- рядок выше, чем II типа. На 2-ой стадии монооксигеназного цикла происходит восстановление комплекса Р450-субстрат. Электрон для восстановления цитохрома Р450 поступает от NADPH-специфичного флавопротеина. На следующих стадиях происходит активация кислорода. Для этих стадий характерно последовательное образование окси- и пероксикомплексов Р450. Оксикомплекс Р450 способен диссоциировать с освобождением суперокисных радикалов, из которых в реакции дисмута- ции генерируется перекись водорода (цикл б). Восстановление окси- комплекса вторым электроном ведет к образованию двухэлектронновос- становленного пероксикомплекса. Считается, что эта стадия является лимитирующей в монооксигеназном цикле. При распаде пероксикомплекса генерируется перекись водорода (цикл в) и образуется реакционноспо- собная частица оксеноида (FeO) , содержащая шестиэлектронный атом кислорода, лигандированный трехвалентным железом. Кислородный атом из этой частицы может переноситься к С-Н-связи субстрата и внедряться в нее. В качестве другого механизма предлагается возможность ацилирования дистального атома кислорода, лигандированного на желе- зе гема. Распад этого комплекса ведет к образованию надкислоты в активном центре Р450. Низкая реакционная способность надкислоты требует дополнительной активации молекулы субстрата. Двухэлектрон- ное восстановление оксеноида ведет к образованию воды из молекулы кислорода (цикл г). Вероятнее всего, единого механизма для реакций, катализируемых цитохромом Р450, не существует.К настоящему времени идентифицированы более 160 разных генов, кодирующих Р450. Сведения о первичной структуре, субстратной специ- фичности, индуцибельности, локализации в клетке, строении гена и многих других свойствах приведены в компьютерной базе данных "Cyto- chrome P450, Database" (CPD), созданной в Институте биомедицинской химии РАМН.Молек. масса различных Р450 колеблется от 44 до 60 кДа. Мономеры гемопротеина состоят из одной полипептидной цепи, содержащей от 45 до 55% неполярных аминокислотных остатков. В отсутствие детергента цитохром существует в виде агрегатов с молек. массой от 300 до 700 кДа. Полная аминокислотная последовательность установлена для более чем 150 цитохромов Р450. Наиболее хорошо исследованы CYP2B4 и CYP1A2, выделенные из микросом печени кроликов после ин- дукции фенобарбиталом и 3-метилхолантреном соответственно. Молекула CYP2B4 состоит из 491 аминокислотных остатковб а CYP1A2 - из 516 аминокислотных остатков. Д. Озолс и др. в 1981 г. и О. Гото и др. в 1983 г. при сравнении первичной структуры гемопротеинов семейств CYP2 и CYP1 обнаружили 2 консервативных участка пролиновый кластер (остатки 30-38) и треонин-сериновый кластер (остатки 296-307). Подобные кластеры найдены и в других Р450. Области цепей 88-120, 160-183, 195-251, 270-295 и С-концевой фрагмент отличаются выражен- ной вариабельностью. Вариабельные участки определяют специфику каждого гемопротеина. С консервативными участками последовательности связывают проявление спектральных и каталитических свойств, общих для гемопротеинов. Такие консервативные участки могут также определять взаимодействие цитохрома с мембраной. У цитохромов CYP101 и CYP2B4, имеющих низкую гомологию общей последовательности (менее 20%), обнаружены два консервативных цистеинсодержащих пептида. Предполагается, что Cys-436 у CYP2B4, Cys-455 у CYP1A2, Cys-412 у CYP101, а также гомологичные им цистеины у других Р450 являются 5- ым аксиальным лигандом гема. Таким образом, обнаруживается высокая степень гомологии гем-связывающего участка у различных форм гемопротеинов. Д.Озолс и др., сравнивая аминокислотную последователь- ность различных цитохромов Р450, выделенных из микросом печени кроликов, обнаружили 90 инвариантных остатков.Исследования спектральных и каталитических свойств мутантных белков позволили выявить функциональную значимость аминокислот, формирующих микроокружение гема. Неполярные аминокислоты Phe-449, Leu-451, Gly-452, Ile-457, Gly-458 необходимы для встраивания гема в апофермент цитохрома Р450, а Arg-451 в мембранных цитохромах взаимодействует с пропионатом гема, подобно His-355 в CYP101. Пред- полагается, что гистидин участвует в связывании субстратов, а Lys- 394, 402, 453, а также другие лизины 139, 144 и 251 могут быть центрами взаимодействия Р450 с другими белками-партнерами. Аминокислоты, содержащие гидроксильные группы, в частности Tyr-380, претендуют на роль 6-ого транстиолатного лиганда железа гема. Но наиболее вероятным кандидатом на эту роль является атом кислорода молекулы воды.Все мембранные цитохромы Р450 на N-концевом фрагменте пептидной цепи имеют короткий гидрофобный участок, содержащий от 12 до 21 аминокислотных остатков. Он выполняет роль якорного пептида и содержит сигнальную последовательность, ответственную за встраивание белка в мембрану. За ним расположена стоп-сигнальная последовательность, останавливающая встраивание пептида в фосфолипидный бислой.Д.Нельсон и Х.Стробел предложили модель локализации гемопротеина в мембране, согласно которой большая часть белка находится вне липидного бислоя, субстрат-связывающий участок контактирует с липидным бислоем, а гем расположен параллельно плоскости мембраны. В некоторых случаях обнаружено, что плоскость гема ориентирована под углом 40-50 . Такие различия могут отражать различия в ориентации гема для Р450 из различных семейств. Неизвестно, погружен ли активный центр гемопротеина в фосфолипидный бислой или находится на поверхности бислоя.В.Уваровым и сотр. проанализирована вторичная структура 19 микросомальных Р450. Обнаружена высокая степень гомологии гем- связывающего участка. Гомология вторичной структуры Р450, как правило, выше, чем гомология соответствующих первичных структур. Для многих форм Р450, несмотря на низкую степень гомологии первичной структуры, получены близкие профили гидрофобности.Единственный Р450, трехмерная структура которого была детально изучена с помощью рентгеновской кристаллографии - это Р450 (101) из P. putida. Т.Поулс и др. исследовали пространственную структуру как самого гемопротеина, так и его комплекса с камфорой. Белок содержит 414 аминокислотных остатков, молек. масса - 47 кДа. Молекула цитохрома представляет собой асимметричную призму с основанием 3,0 нм и сторонами по 5,5 и 6,0 нм. Белок содержит 3 вида структур: 4 анти- параллельных спиральных участка, смесь спиралей и неупорядоченных структур, перемежающихся параллельными бета-структурами. Гем расположен между двумя параллельными спиралями; с пропионовыми группами гема взаимодействуют остатки Arg-112, Arg-229 и His-335, другие аминокислоты, окружающие гем, неполярны: гем не выходит на поверх- ность молекулы. Наименьшее расстояние от поверхности до гема составляет около 0,8 нм. В связывании субстрата (камфоры) принимает участие гидроксильная группа остатка Tyr-96. Молекула субстрата располагается на расстоянии 0,4 нм над пиррольным кольцом A протопорфирина IX, в непосредственной близости от места связывания с СО. Кроме водородной связи с Tyr-96 в ориентации камфоры участвуют гидрофобные аминокислоты.Цитохром Р450 относится к числу наиболее интенсивно изучаемых ферментов не только в связи с его важной ролью в организме, но и в связи с особенностями его строения и механизма функционирования.