logo
Гилберт С

Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

90 ГЛАВА 10

Рис. 10.11. Обнаружение вирусоспецифических мРНК. кодирующих КСФ-г,м. Представлены результаты Нозерн-блоттинга мРНК из 8 клонов клеток, инфицированных ретровирусом, содержащим ген КСФ-г,м мыши (дорожки 2–9), и двух клонов, инфицированных аналогичным вирусом, лишенным ДНК гена КСФ-г,м (дорожки 10 и 11). Транскрипт, кодируемый вирусом, содержит больше РНК в лидерной последовательности между сайтами инициации транскрипции и трансляции. Поэтому он превосходит по размерам обычную КСФ-г,м мРНК мыши (дорожка 1) и остается в верхней части геля. (Из Lang et al., 1985. Фотография с любезного разрешения К. А. Lang.)

Рис. 10.12. Нозерн-блот для гена алкогольдегидрогеназы в процессе развития Drosophila melanogaster. Хромосомная локализация этого гена показана на рис. 9.1. РНК экстрагировали на стадиях зародыша (Е), личинки (L), предкуколки (РР) куколки (Р), имаго (А) и затем равные количества (5 мкг) вносили в карманы геля. После электрофореза РНК переносили блоттингом на нитроцеллюлозный фильтр и инкубировали в растворе, содержащем одноцепочечный фрагмент ДНК гена алкогольдегидрогеназы. Нозерн-блот показывает, что в ходе эмбриогенеза накапливается незначительное количество РНК этого гена, тогда как в тканях личинки происходит значительное увеличение количества мРНК алкогольдегидрогеназы. Когда личинки начинают окукливаться, в них прекращается накопление этой мРНК. Однако у взрослых особей отмечается высокое содержание этой мРНК. (Из Savakis, Ashburner, 1985.)

венный КСФ-г,м. Таким образом, они стимулируют себя к непрерывному делению, образуя в конечном счете опухоли. [Это наблюдение подтверждало гипотезу Тодаро и др. (Todaro et al., 1977), которые предсказали подобный феномен в 1977 г. Эти опыты по индукции опухолей будут подробно рассматриваться в гл. 20.]

Одним из важных применений Нозерн-блота является определение времени начала экспрессии какого-либо конкретного гена. Исследователь может выделить препараты РНК из зародышей на различных стадиях развития и разделить их с помощью электрофореза на параллельных дорожках геля. После переноса расфракционированной РНК на нитроцеллюлозный фильтр методом блоттинга фильтр со связанной РНК инкубируют в растворе, содержащем радиоактивный одноцепочечный фрагмент ДНК исследуемого гена. Эта ДНК будет связываться только с теми участками, где находится комплементарная РНК. Таким образом, если мРНК для данного гена присутствует на определенной стадии эмбриогенеза, то радиоактивная ДНК должна связываться с ней и ее можно зарегистрировать с помощью радиоавтографии. Радиоавтографы этого типа называют Нозерн-блотами развития. На рис. 10.12 показан Нозерн-блот развития для экспрессии гена алкогольдегидрогеназы у Drosophila. Можно видеть, что мРНК для этого белка синтезируется на всех стадиях зародышевого развития, кроме стадии куколки, и у взрослой особи (Savakis, Ashburner, 1985).