Сайт-специфичный мутагенез и трансляция разрыва

Одно из наиболее продуктивных приложений методик с использованием рекомбинантных ДНК связано с возможностью изменить конкретный нуклеотид в клонированном гене и затем выяснить, влияет ли это изменение на функционирование гена. Специфическое мутирование осуществляется с помощью олигонуклеотид-направленного сайт-специфичного мутагенеза. Для этого сначала определяют последовательность ДНК и искусственно синтезируют олигонуклеотид. который имеет правильную последовательность, за исключением одной (или нескольких) замен. Затем этот олигонуклеотид длиной от 12 до 15 пар оснований смешивают с одноцепочечной рекомбинантной плазмидой, содержащей последовательности кДНК к гену дикого типа. Олигонуклеотид будет гибридизоваться с плазмидой, несмотря на то что одна из его пар оснований некомплементарна. Модифицированный олигонуклеотид можно затем использовать в качестве затравки для репликации оставшейся части плазмиды и клонированной ДНК с помощью ДНК-полимеразы 1 Е. coli. Далее концы отреплицированных плазмид связываются ковалентно с помощью ДНКлигазы и плазмиды вводятся в клетки Е. coli. Половина реплицирующихся плазмид восстанавливает