Клонирование генов

Сравнительно недавно, используя методы гибридизации нуклеиновых кислот, биологам развития на основе подхода, названного клонированием генов, удалось выделить отдельные гены. Если бы кто-то захотел изолировать, например, отдельный ген человека, то он столкнулся бы с неразрешимыми проблемами. Геном человека содержит ДНК в количестве, достаточном для кодирования примерно 2 х 10⁵ генов размером около 15 000 пар оснований каждый. Обычные биохимические процедуры не позволяют отделить один ген от всех остальных. Однако техника клонирования генов позволяет выделить специфические участки ДНК, а также провести их амплификацию до огромного числа копий.

Первый этап в этой процедуре заключается в разрезании ядерной ДНК на различные фрагменты. Это осуществляется с помощью инкубации ДНК в присутствии рестрикционной эндонуклеазы (обычно называемой «рестриктазой»). Эти эндонуклеазы являются, как правило, бактериальными ферментами, которые узнают специфические последовательности ДНК (табл. 10.1) и расщепляют ДНК в этих участках (Nathans, Smith, 1975). Например, если ДНК человека инкубируют с ферментом BamH1 (выделенным из Bacillus amyloliquifaciens, штамм H), то ДНК разрезается в каждом участке, где имеется последовательность ГГАТЦЦ. Продуктом реакции являются различные по длине фрагменты ДНК. содержащие Г на одном конце и ГАТЦЦ на другом (рис. 10.3).

Следующий этап – включение полученных фрагментов ДНК в векторы для клонирования. Эти векторы представляют собой кольцевые молекулы ДНК, которые реплицируются в бактериальных клетках независимо от бактериальной хромосомы. Обычно используются плазмиды, устойчивые к тем или иным лекарственным препаратам, или специально модифицированные вирусы, которые особенно эффективны в случае клонирования больших фрагментов ДНК. Подобную плазмиду можно сконструировать таким образом, чтобы она содержала только один чувствительный к BamH1 сайт. Ее можно раскрыть при инкубации с данной рестриктазой. После раскрытия она смешивается с фрагментированной ДНК. Во многих случаях нарезанные фрагменты ДНК оказываются включенными в векторы благодаря комплементарности их концов открытым концам вектора. Затем эти фрагменты могут соединяться ковалентно в растворе, содержащем фермент ДНК-лигазу. Итогом всей процедуры являются бактериальные плазмиды. каждая из которых содержит одиночный фрагмент ДНК человека. Их называют рекомбинантными плазмидами или просто рекомбинантной ДНК (Cohen et al.. 1973; Blattner et al.. 1978).