6.2.3. Получение бактериальных удобрений

Микрофлора почвы оказывает непосредственное влияние на её плодородие и, как следствие, на урожайность растений. Почвенные микроорганизмы в процессе роста и развития улучшают структуру почвы, накапливают в ней питательные вещества, минерализуют различные органические соединения, превращая их в легко усвояемые растением компоненты питания. Для стимуляции этих процессов применяют различные бактериальные удобрения, обогащающие ризосферу растений полезными микроорганизмами. Микроорганизмы, используемые для производства бактериальных препаратов, способствуют снабжению растений не только элементами минерального питания, но и физиологически активными веществами (фитогормонами, витаминами и др.). В настоящее время выпускают такие бактериальные удобрения, как нитрагин, ризоторфин, азотобактерин, фосфобактерин, экстрасол.

Препараты клубеньковых бактерий. Препараты клубеньковых бактерий нитрагин и ризоторфин производятся на основе активных жизнеспособных клубеньковых бактерий из рода Rhizobium. Эти бактерии в симбиозе с бобовыми культурами способны фиксировать свободный азот атмосферы, превращая его в соединения, легкоусвояемые растением.

Характеристика бактерий. Бактерии рода Rhizobium – строгие аэробы. Среди них различают активные, малоактивные и неактивные культуры. Критерием активности клубеньковых бактерий служит их способность в симбиозе с бобовым растением фиксировать атмосферный азот и использовать его в виде соединений для корневого питания растений.

Фиксация атмосферного азота возможна только в клубеньках, образующихся на корнях растений. Возникают они при инфицировании корневой системы бактериями из рода Rhizobium. Заражение корневой системы происходит через молодые корневые волоски. После внедрения бактерии прорастают внутри них до самого основания в виде инфекционной нити. Выросшие нити проникают сквозь стенки эпидермиса в кору корня, разветвляются и распределяются по клетками коры. При этом индуцируется деление клеток хозяина и разрастание тканей. В месте локализации бактерий на корне растения-хозяина образуются клубеньки, в которых бактерии быстро размножаются и располагаются по отдельности или группами в цитоплазме растительных клеток. Сами бактериальные клетки увеличиваются в несколько раз и меняют окраску. Если клубеньки имеют красноватую или розовую окраску, обусловленную наличием пигмента легоглобина (леггемоглобина) – аналог гемоглобина крови животных, то они способны фиксировать молекулярный азот. Неокрашенные («пустые») или имеющие зеленоватую окраску клубеньки не фиксируют азот.

Бактерии, находящиеся в клубеньках, синтезируют ферментную систему с нитрогеназной активностью, восстанавливающую молекулярный азот до аммиака. Ассимиляция аммиака происходит, в основном, путем вовлечения его в ряд ферментативных превращений, приводящих к образованию глутамина и глутаминовой кислоты, идущих в дальнейшем на биосинтез белка.

Помимо критерия активности в характеристике клубеньковых бактерий используют критерий вирулентности. Он характеризует способность микроорганизма вступать в симбиоз с бобовым растением, то есть проникать через корневые волоски внутрь корня и вызывать образование клубеньков. Большое значение имеет скорость такого проникновения. В симбиотическом комплексе растение – Rhizobium бактерии обеспечиваются питательными веществами, а сами снабжают растение азотистым питанием. С вирулентностью связана и видовая избирательность, которая характеризует способность данного вида бактерий к симбиозу с определенным видом бобового растения. Классификация различных видов Rhizobium учитывает растение-хозяина, например: Rhizobium phaseoli – для фасоли, Rhizobium lupini – для люпина, сараделлы и т.д. Вирулентность и видоспецифичность взаимосвязаны и не являются постоянными свойствами штамма.

Технология производства сухого нитрагина – порошок светло-серого цвета, содержащий в 1 г не менее 9 млрд. жизнеспособных бактерий в смеси с наполнителем. Влажность не превышает 5 – 7 %.

Промышленное производство имеет типичную схему:

• Составление питательной среды. На всех этапах промышленного культивирования применяют питательную среду, включающую такие компоненты, как меласса, кукурузный экстракт, минеральные соли в виде сульфатов аммония и магния, мел, хлорид натрия и двузамещенный фосфат калия.

• Подготовка посевного материала. Для производства посевного материала исходную культуру клубеньковых бактерий выращивают на агаризованной среде, содержащей отвар бобовых семян, 2 % агара и 1 % сахарозы, затем культуру размножают в колбах на жидкой питательной среде в течение 1 – 2 суток при 28 –30 ^оС и рН 6,5 – 7,5.

• Внесениение посевного материала.

• Размножение культуры. Основная ферментация идет при тех же условиях в течение 2 – 3 суток.

Готовую культуральную жидкость сепарируют, получается биомасса в виде пасты с влажностью 70 – 80 %. Пасту смешивают с защитной средой, содержащей тиомочевину и мелассу (1:20) и направляют на высушивание. Сушат путем сублимации ( в вакуум-сушильных шкафах). Высушенную биомассу размалывают. Производительнее высушивание в распылительных сушках, но при этом 75 % клеток теряют жизнеспособность. Препараты сухого нитрагина фасуют и герметизируют в полиэтиленовые пакеты по 0.2 – 1 кг, хранят при температуре 15 ^оС не более 6 месяцев. Семена опудривают перед посевом. Внесение нитрагина повышает урожайность в среднем на 15 –25 %.

Препараты свободноживущих почвенных микроорганизмов. Азотобактерин – бактериальное удобрение, содержащее свободноживущий почвенный микроорганизм

Характеристика бактерий. Azotobacter chroococcum, способный фиксировать до 20 мг атмосферного азота на 1 г использованного сахара. Внесенные в качестве удобрения в почву бактерии также выделяют биологически активные вещества (никотиновую и пантотеновую кислоты, пиридоксин, биотин, гетероауксин, гиббереллин и др.). Эти вещества стимулируют рост растений. Кроме того, продуцируемые Azotobacter фунгицидные вещества из группы анисомицина угнетают развитие некоторых нежелательных микроскопических грибов в ризосфере растения.

Все виды Azotobacter строгие аэробы. Чувствительны к содержанию в среде фосфора и развиваются лишь при высоком его содержании в питательной среде. Азотфиксирующая способность культуры подавляется аммиаком (вообще содержание в среде связанного азота угнетает азотфиксацию). Стимулируют процесс фиксации азота соединения молибдена.

Установлено, что при фиксации азота процесс его восстановления протекает на одном и том же синтезируемом азотобактером ферментном комплексе и лишь конечный продукт (аммиак) отделяется от фермента. Нитрогеназная азотфиксирующая система представляет собой мультиферментный комплекс, содержащий не связанное с геном железо, молибден и SH-группы.

Технология производства азотобактерина. Микробиологическая промышленность выпускает несколько видов азотобактерина: сухой, почвенный и торфяной.

Сухой азотобактерин – активная культура высушенных клеток азотобактера с наполнителем. В 1 г препарата содержится не менее 0,5 млрд. жизнеспособных клеток.

Технология получения сухого азотобактерина имеет много общего с технологией производства сухого нитрагина. Культуру микроорганизма выращивают методом глубинного культивирования на среде, содержащей те же компоненты, что и при культивировании клеток Rhizobium. Дополнительно вводят только сульфаты железа и марганца, а также сложную соль молибденовой кислоты, рН 5,7 – 6,5.

Процесс ферментации проводят до стационарной фазы развития культуры, так как в этой фазе биологически активные вещества выделяются из клетки и остаются в культуральной жидкости. Биологически активные вещества могут также полностью или частично теряться при высушивании, однако жизнеспособные клетки быстро восстанавливают способность их продуцировать. Высушенную культуру стандартизируют, фасуют в полиэтиленовые пакеты по 0.4 – 2 кг и хранят при температуре 15 ^оС не более 3 месяцев.

Использовать азотобактерин рекомендуется только на почвах, содержащих фосфор и микроэлементы. Азотобактерин применяют для бактеризации семян, рассады, компостов. При этом урожайность увеличивается на 10-15 %. Семена зерновых опудривают сухим азотобактерином из расчета 100 млрд. клеток на 1 гектарную порцию семян. Картофель и корневую систему рассады равномерно смачивают водной суспензией бактерий. Для получения суспензии 1 гектарную норму (300 млрд. клеток) разводят в 15 литрах воды. При обработке почвенным или торфяным азотобактерином семена перемешивают с увлажненным препаратом и для равномерного высева подсушивают. Корневую систему рассады смачивают приготовленной суспензией.

Препарат фосфобактерин – бактериальное удобрение, содержащее споры микроорганизма Bacillus megaterium var. phosphaticum. Представляет собой порошок светло-серого или желтоватого цвета.

Характеристика бактерий. Bacillus megaterium var. phosphaticum представляют собой мелкие, грамположительные аэробные спорообразующие палочки размером 2*6 мкм. Клетки содержат значительное количество соединений фосфора. В ранней стадии развития это подвижные одиночные палочки, при старении образуют эндоспоры, локализующиеся в одном из концов клетки. В силу вышеизложенного технология выращивания сводится к получению спор.

Бактерии обладают способностью превращать сложные фосфорорганические соединения (нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды и т.д.) и трудноусвояемые минеральные фосфаты в доступную для растений форму. Кроме этого бактерии вырабатывают биологически активные вещества (тиамин, пиридоксин, биотин, пантотеновую и никотиновую кислоты и др.), стимулирующие рост растения. Фосфобактерин относится к числу препаратов со стимулирующим эффектом.

Технология производства фосфобактерина. В целом производство фосфобактерина похоже на производство азотобактерина и препаратов клубеньковых бактерий.

Состав питательной среды в процентах: кукурузный экстракт – 1,8; меласса – 1,5; сульфат аммония – 0,1; мел – 1; остальное – вода. Культивирование ведется глубинным методом в строго асептических условиях при постоянном перемешивании и принудительной аэрации до стадии образования спор. Основные параметры проведения процесса: температура 28 – 30 ^оС, рН 6,5 – 7,5, длительность культивирования 1,5 – 2 суток.

Полученную в ходе культивирования биомассу клеток отделяют центрифугированием и высушивают в распылительной сушилке при температуре 65 – 75 ^оС до остаточной влажности 2 – 3 %. Высушенные споры смешивают с наполнителем. Готовый препарат должен содержать не менее 8 млрд. клеток в 1 г. Расфасовывают препарат в полиэтиленовые пакеты по 50-500 г. В отличие от нитрагина и азотобактерина фосфобактерин обладает большей устойчивостью при хранении.

Фосфобактерин рекомендуют применять на черноземных почвах, которые содержат наиболее значительное количество фосфороорганических соединений. Необходим для повышения урожайности зерновых, картофеля, сахарной свеклы и др. сельскохозяйственных растений. Семена обрабатывают смесью сухого фосфобактерина с наполнителем (золой, почвой и др.) в соотношении 1:40. На 1 гектарную порцию требуется 5 г препарата и 200 г наполнителя. Клубни картофеля равномерно увлажняют суспензией спор, приготовленной из расчета 15 г препарата на 15 л воды. Урожай при этом повышается на 10 %.