logo
Макаревич Е

3.4.2. Генетическая модификация микроорганизмов

Клетки организмов могут приобретать новые свойства в результате изменения их генома путем встраивания или исключения отдельных генов или их групп. Для этого используют метод получения рекомбинантных, т. е. содержащих чужеродный ген, ДНК, которые затем вводятся в организм реципиента, становятся составной частью его генетического аппарата. Этот процесс состоит из нескольких этапов:

1. Выделение фрагмента гена, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую интересующий генетический элемент из цепочки ДНК с использованием ферментов-рестриктаз.

2. Встраивание ранее выдлеленного участка ДНК в вектор путем лигирования.

3. Введение рекомбинантная ДНК в живые клетки. Организмы, несущие в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента, – трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трансгенным.

Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Ключевыми в этом определении являются слова «фрагмент ДНК» и «объединение in vitro», что указывает на сущность генетической инженерии и ее отличие от всех остальных методов получения гибридных (или химерных) организмов, таких как генетическая селекция, эмбриональная инженерия и т.д. Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединенные в бесклеточной системе два компонента: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чужеродной») ДНК, содержащий интересующие исследователя генетические элементы.

Технология рекомбинантных ДНК позволяет решать такие за дачи, как определение строения и функций белков, их индивидуальных доменов, а также расшифровывать механизмы регуляции экспрессии генов, получение многие белки, участвующие в регуляции обменных процессов, клеточной пролиферации и развитии организма. Используя технологию рекомбинантных ДНК, получают минорные клеточные белки в больших количествах и проводят тонкие биохимические исследования структуры и функций белков, а также осуществляют детальный химический анализ генетического материала.

Получение рекомбинантной ДНК осуществляется с помощью следующих методов:

  1. Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот – ДНК и РНК) – определение их первичной аминокислотной или нуклеотидной последовательности (от англ. sequence - последовательность). В результате получается линейное символьное описание, которое cжато резюмирует атомную структуру молекулы. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК позволяет идентифицировать генетически важные участки ДНК. Секвенирование дает возможность довольно быстро определить полную нуклеотидную последовательность сегмента длиной 100 – 500 нуклеотидных пар, образующегося при расщеплении ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

  2. Рестрикция – разрезание ДНК на фрагменты ферментами-рестриктазами, которые режут ДНК на отрезки в определенных местах с целью выделения того или иного гена из цепочки ДНК. Всякая рестриктаза может опознать лишь одну стандартную последовательность из нескольких нуклеотидов. Молекулы рестриктазы химически связываются с ними и в этих местах рвут цепь ДНК. В настоящее время известно более 400 рестриктаз, способных расщеплять ДНК по 120 различным последовательностям нуклеотидов.

  3. Лигирование – процесс «сшивания» генов с помощью особых ферментов, называемых лигазами. Лигазы сшивают участки ДНК, образовывая между их крайними нуклеотидами химическую связь.

  4. Гибридизация нуклеиновых кислот. Метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100 °С в сильно щелочной среде (рН 13). При нагревании до 100 °С комплементарные пары оснований разрушаются и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК («плавлением»). Выдерживание комплементарных цепей при температуре 65 °С приводит к их спариванию и восстановлению структуры двойной спирали (гибридизация, ренатурация, или «отжиг».

  5. Трансформация– процесс введения рекомбинантной ДНК в живые клетки. Для того, чтобы рекомбинантная ДНК стала частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться в ее геном и реплицироваться за ее счет, либо быть способной к автономной репликации. Для этого используют векторы – мобильные генетические элементы: вирусы, плазмиды и транспозоны. Эти элементы могут присоединять те или иные гены к своей ДНК, а затем, оказавшись в клетке-хозяине, встраиваться вместе с чужеродным геном в хромосому хозяина, которая потом реплицируется уже вместе со всей этой новой последовательностью. В общих чертах это напоминает трансдукцию, имеющую место и в природе.