3.4.4.2. Генетическая трансформация клеток бактерий
Обработка клеток лизоцимом в изотоническом растворе. В настоящее время бактерия E. coli является самой изученной клеткой из всех существующих.
Протопласт E. coli «одет» в муреиновый «мешок», прилегающий к внешней мембране. E. coli относится к микроорганизмам, не обладающим физиологической компетентностью к поглощению экзогенной ДНК. Поэтому необходимо создать условия, позволяющие преодолеть барьер клеточной стенки. Сначала получают сферопласты путем обработки клеток лизоцимом в изотоническом растворе.
Липополисахаридный слой внешней мембраны грамотрицательной бактерии стабилизирован двухвалентными катионами, поэтому для разрыхления внешней мембраны E. coli используется комплексообразователь этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), которая связывает двухвалентные катионы. При обработке EDTA часть липополисахаридов высвобождается из внешней мембраны клетки, и лизоцим может достигнуть муреинового мешка и гидролизовать его. Это ведет к повышению проницаемости клеточной оболочки.
Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют клетки и фрагменты ДНК, которые необходимо ввести в клетки (рис. 3.8).
Рис. 3.8. Метод электропорации
Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200 – 350 В, длительность импульса 54 мс), приводящие к образованию пор (электропробой) в цитоплазматической мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. При этом объем клетки увеличивается. Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и реципиентных клеток для каждой системы клеток подбирают экспериментально, с тем чтобы достичь высокого процента поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что в оптимальных условиях электропорации количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток. Электропорация – физический, а не биохимический метод, и это, по-видимому, обусловливает его широкое применение. Многочисленные исследования продемонстрировали, что электропорация может успешно использоваться для введения молекул ДНК в разные типы клеток, такие как культивируемые клетки животных, простейшие, дрожжи, бактерии и протопласты растений. Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно большей напряженности (10 кВ/см и более), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1 – 2 кВ/см.
- 020209.65 «Микробиология»
- Глава 1. Характеристика микроорганизмов - объектов биотехнологических производств
- 1.1. Строение прокариотической (бактериальной) клетки
- 1.2. Размножение бактерий
- 1.3. Строение эукариотической клетки
- 1.4. Характеристика наиболее важных представителей различных классов грибов, их размножение
- 1.5. Дрожжи. Их формы, размеры. Размножение дрожжей. Принципы классификации дрожжей
- Глава 2. Метаболизм. Принципы регуляции обмена веществ микрорганизмов
- Глава 3. Генетика микроорганизмов. Пути совершенствования микробиологических производств методами генной инженерии
- 3.1. Генотип и фенотип микроорганизмов
- 3.2. Формы изменчивости микроорганизмов
- 3.3. Типы мутантных штаммов продуцентов
- 3.4. Способы получения мутантных штаммов микроорганизмов
- 3.4.1. Селекционные методы получения мутантов
- 3.4.2. Генетическая модификация микроорганизмов
- 3.4.3. Методы генной инженерии
- 3.4.4. Конструирование рекомбинантной днк
- 3.4.4.1. Встраивание днк в вектор
- 3.4.4.2. Генетическая трансформация клеток бактерий
- 3.4.4.3. Экспрессия чужеродных генов в клетках бактерий
- Глава 4. Культивирование микроорганизмов
- 4.1. Рост и развитие микроорганизмов
- 4.2. Оптимальные условия культивирования
- 4.3. Промышленные способы культивирования микроорганизмов
- Глава 5. Общие принципы биотехнологических производств
- 5.1. Основная схема технологического процесса
- Х ранение
- 5.2. Этапы технологического процесса
- 5.2.1. Приготовление питательной среды
- 5.2.2. Подготовка посевного материала
- 5.2.3. Ферментация (культивирование)
- 5.2.4. Выделение целевого продукта
- 5.2.5. Очистка целевого продукта
- Глава 6. Производство микробной биомассы
- 6.1. Получение и использование биомассы одноклеточных
- 6.1.1. Получение дрожжевого белка
- 6.1.2. Получение бактериальной биомассы
- 6.1.3. Получение грибного белка (микопротеина)
- Получение водорослевого белка
- 6.2. Получение энзиматически активной биомассы
- 6.2.1. Получение хлебопекарских дрожжей
- 6.2.2. Получение заквасок молочной промышленности
- 6.2.3. Получение бактериальных удобрений
- 6.3. Получение и использование микробных инсектицидов
- 6.3.1. Получение бактериальных энтомопатогенных препаратов
- 6.3.2. Получение грибных энтомопатогенных препаратов
- 6.3.3. Получение вирусных энтомопатогенных препаратов
- 6.4. Получение и использование вакцин
- Глава 7. Производство ферментных препаратов
- 7.1. Технология получения ферментов микроорганизмов
- 7.2. Иммобилизованные ферменты
- 7.3. Иммобилизация клеток
- 7.4. Промышленные процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток
- Глава 8. Получение продуктов микробиального синтеза
- 8.1. Биотехнология получения первичных метаболитов
- 8.1.1. Производство аминокислот
- 8.1.2. Производство витаминов
- 8.1.3. Производство органических кислот
- 8.2. Биотехнология получения вторичных метаболитов
- 8.2.1. Получение антибиотиков
- 8.3. Биотехнология получения метаболитов, с использованием генномодифицированных микроорганизмов
- Глава 9. Использование микроорганизмов в пищевой промышленности
- 9.1. Производства, основанные на спиртовом брожении
- 9.1.1. Хлебопекарное производство
- 9.1.2. Производство пищевого спирта
- 9.1.3. Производство пива
- 9.1.4. Производство вина
- 9.2. Производства, основанные на молочнокислом брожении
- 9.2.1. Производство кисломолочных продуктов
- 9.2.2. Производство сыров
- Глава 10. Использование микроорганизмов в охране окружающей среды
- 10.1. Биологическая обработка органических отходов
- 10.1.1. Биологическая очистка сточных вод
- 10.1.2. Биологическая обработка твердых отходов
- 10.2. Биоремедиация загрязненных почв и грунтов
- Глава 11. Использование микроорганизмов в технологии металлов