§ 57. Инструменты генетической инженерии

Ферменты разрезания и сшивания нужных фрагментов ДНК. Для того, чтобы искусственным путем наделить организм новыми наследственными свойствами (создать трансгенную особь), нужно ввести в него хотя бы один чужеродный ген. Причем, необходимо приготовить (сконструировать) фрагмент чужеродной ДНК, содержащий этот нужный ген. Осуществляется эта процедура с помощью двух операций: "разрезания" и "сшивания". Роль портняжных инструментов играют ферменты рестриктазы и лигазы.

Рестриктазы (своеобразные молекулярные ножницы), действуя на двухцепочечную ДНК, "узнают" в ней определенную последовательность нуклеотидов. Причем, каждая рестриктаза узнает только свою последовательность ДНК, прикрепляется к ней и разрезает ее в месте прикрепления. Рестриктазам безразлично, какую ДНК разрезать – человека или растения, бактерии или вируса, лишь бы в ней были распознаваемые участки.

Обычно рестриктазы распознают в молекулах ДНК очень короткие, но строго специфичные для каждого фермента участки длиной в 4 – 6 пар нуклеотидов и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков или с некоторым смещением. В первом случае образуются обрывки с ровными (тупыми) концами, а во втором – стороны разрезаемых цепочек ДНК заходят одна за другую. Такие одноцепочечные концы называются "липкими", поскольку они могут, как бы слипаться между собой в силу комплементарности.

Ярким примером рестриктазы второго типа является EcoRI, которая узнает фрагмент ДНК из шести нуклеотидов ГААТТЦ, и режет эту последовательность ДНК ассиметрично, «ступенькой» между нуклеотидами Г и А (рис. ).

В результате место разреза в одной цепи смещено по отношению к другой на 4 пары оснований. При таком разрезе образуется два выступающих конца. Эти концы притягиваются друг к другу, желая восстановить свои старые связи и скрепиться, как им и положено, водородными мостиками (см. Принцип комплементарности, § 6).

Если с той же EcoR1 получить фрагменты ДНК из различных организмов (допустим слона и лягушки) то все они будут иметь одинаковые, подходящие друг к другу “липкие концы”. Скрепить выступающие липкие концы двух молекул ДНК помогает другой фермент - ДНК-лигаза. Он лигирует, то есть “сшивает“ между собой сахарофосфатные остовы двух фрагментов с образованием полной структуры двойной спирали ДНК. Внешне она ничем не отличается от обычной ДНК.

Ниже в качестве примера приведены последовательности двух фрагментов ДНК, выделенных из организмов разных видов.

1) 5`-АГЦАТАЦТГТГААТТЦАЦА-3`

3`-ТЦГТАТГАЦАЦТТААГТГТ-5`

2) 5`-АТГААТТЦТТАГЦАТАЦ-3`

3`-ТАЦТТААГААТЦГТАТГ-5`

Если мы хотим получить гибридную молекулу ДНК, то на первом этапе необходимо разрезать представленные фрагменты ДНК разных видов с помощью подходящих рестрикционнных ферментов. В данном случае можно использовать рестриктазу EcoRI, которая расщепит ДНК двух видов на четыре новых фрагмента 1а, 1б и 2а, 2б с липкими концами ААТТ и ТТАА:

1а) 5`-АГЦАТАЦТГТГ 1б) ААТТЦАЦА-3`

3`-ТЦГТАТГАЦАЦТТАА ГТГТ-5`

2а) 5`-АТГ 2б) ААТТЦТТАГЦАТАЦ-3`

3`-ТАЦТТАА ГААТЦГТАТГ-5`

В ходе второго этапа необходимо смешать нужные нам фрагменты разных видов, допустим, 1а и 2б. В результате выступающие липкие концы скрепятся между собой, как им и положено, водородными связями в силу комплементарности.

5`-АГЦАТАЦТГТГ А-А-Т-Т-ЦТТАГЦАТАЦ-3`

3`-ТЦГТАТГАЦАЦ-Т-Т-А-А ГААТЦГТАТГ-5`

Окончательное скрепление фрагментов 1а и 2б двух молекул ДНК производит фермент ДНК-лигаза, которая “сшивает“ между собой сахарофосфатные остовы обоих фрагментов между нуклеотидами Г и А с образованием полной структуры ДНК. Таким образом, получение межвидовой гибридной молекулы ДНК завершено.

Сейчас в арсенале генных инженеров имеется более 500 различных рестриктаз, способных разрезать ДНК примерно в 120 различных местах.

Векторы – устройства для доставки и клонирования чужеродных генов. С помощью ферментов рестриктаз и лигаз исследователи научились конструировать разнообразные по своим составным частям гибридные ДНК, путём сшивки различных фрагментов in vitro.

Но как полученным фрагментам ДНК, несущим ценные гены попасть в клетку и начать там “работать” – производить белки?

Для доставки чужеродных генов в различные организмы учёные стали применять специальные устройства, так называемые векторы. Вектор – это молекула ДНК, способная самостоятельно реплицироваться в клетках различных организмов и обеспечивать размножение (клонирование) и работу (экспрессию) встроенного в неё искусственно какого-либо гена. В английской литературе вектор часто обозначается словом vehicle – повозка.

Идеальными векторными молекулами, созданными самой природой, оказались плазмиды, представляющие собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, самостоятельно живущие в цитоплазме бактерий. Плазмиды способны к автономной репликации, обладают генами устойчивости к различным антибиотикам, что позволяет легко обнаружить их присутствие в клетках. Плазмиды могут внедряться в хромосому клетки хозяина, а также имеют участки ДНК (сайты рестрикции) для действия ряда рестриктаз. Первым успешным вектором, который начали использовать в генной инженерии, стала кольцевая плазмида pSC101. Она несет только один участок расщепления рестриктазой EcoR1 и превращается под действием этого фермента из кольцевой в линейную молекулу, концы которой могут «слипаться» между собой или с любыми фрагментами другой ДНК, полученными под действием той же рестриктазы. Этапы введения фрагмента чужеродной ДНК в простейший плазмидный вектор pSC101 с помощью рестриктазы EcoR1 и последующее внедрение рекомбинантной плазмиды в бактерию Кишечная палочка (E. coli) для клонирования (размножения) нужного рекомбинантного гена схематически показаны на рис. .

По мере развития методов генной инженерии совершенствовались и плазмидные векторы. Широкое распространение получила плазмида pBR322 а позднее другие классы плазмидных векторов несущие важный функциональный ген lac Z в котором расположен полилинкер, искусственно созданный участок множественного клонирования, содержащий более 10 сайтов рестрикции.

Помимо плазмид в качестве векторов стали успешно использовать фаги и вирусы. Позже были созданы космиды – особый тип векторов, сочетающих свойства плазмиды и фага.

Таким образом, последовательно была создана основная триада элементов техники генной инженерии: выделение генов, «сшивание» их с вектором, доставка гибридной структуры (конструкции) в конкретный организм, где она сможет размножаться и наследоваться в потомстве.

1.Что называют рестриктазами и какую функцию они выполняют? 2.Чем отличаются разрезанные фрагменты ДНК с липкими и тупыми концами? 3. Как называются ферменты, которые лигируют (сшивают) фрагменты ДНК с образованием полной двухцепочечной структуры? 4. Что такое векторы, какие типы векторов вам известны? 5. Какую из нижеприведенных последовательностей ДНК можно разрезать с помощью рестриктазы EcoRI?

а) 5`-АГЦГТАЦТГТГААТТЦАЦА-3` б) 5`-ААЦАЦАЦТГТГАТТТЦАГЦ-3`

3`-ТЦГЦАТГАЦАЦТТААГТГТ-5` 3`-ТТГТГТГАЦАЦТАААГТЦГ-5