4.2. Оптимальные условия культивирования

Накопление желаемых микроорганизмов происходит за счет создания элективных условий культивирования, благоприятных для данной группы. При оценке воздействия некоторых внешних факторов различают три кардинальные точки: минимум, оптимум и максимум. Развитие микроорганизмов возможно между минимальной и максимальной границами. При оптимальных условиях жизнедеятельность микроорганизма проявляется наиболее интенсивно.

Закон минимума: если хотя бы один фактор воздействия будет находиться ниже минимума или выше максимума, микроорганизм не сможет развиваться даже при оптимальных значениях всех остальных факторов.

Чтобы культура микроорганизмов могла нормально расти, размножаться и осуществлять биосинтез какого-то вещества, необходимы оптимальные условия окружающей среды (химические и физические).

При нарушении оптимальных границ этих факторов нарушается обмен веществ, прекращается или ограничивается рост и размножение культуры.

Состав питательной среды. Потребность микроорганизмов в соответствующих веществах выясняют, культивируя их на синтетических средах, которые состоят из компонентов чистых веществ. Изменяя количество одного из компонентов среды и сохраняя остальные на оптимальном уровне, можно установить, какие вещества и в каких концентрациях необходимы для культивирования соответствующего микроорганизма.

В состав практически любой питательной среды входят такие компоненты, как вода, соединения углерода, азота, фосфора и других минеральных веществ, витамины.

Источники углерода. Легкодоступными источниками углерода в питательной среде считаются сахара: глюкоза, сахароза, лактоза, за ними следуют многоатомные спирты: глицерин, маннит и др. Далее следуют полисахариды: целлюлоза, гемицеллюлоза, крахмал, которые могут быть источниками углерода либо после превращения их в усвояемые микроорганизмами моно- и низкомолекулярные олигосахариды, либо микроорганизмы должны иметь набор ферментов, гидролизующих эти вещества. Такими микроорганизмами являются плесневые грибы родов Aspergillus, Penicillium, бактерии рода Bacillus и другие.

На практике встречается большое количество микроорганизмов, которые успешно утилизируют органические кислоты, особенно в анаэробных условиях.

Низкомолекулярные спирты: метанол и этанол - относятся к числу перспективных видов сырья. Многие дрожжи родов Candida, Hansenula и др. способны ассимилировать этанол.

Некоторые виды микроорганизмов (незначительная часть) используют в качестве источника углерода и энергии углеводороды: н-алканы и некоторые фракции нефти.

Концентрация этих веществ в среде может изменяться от десятых долей процента до 20%. Абсолютное содержание источника углерода для получения определенного количества нужного метаболита или биомассы рассчитывают, используя экспериментально определенные экономические коэффициенты выхода

Источники азота. Источниками азота в питательной среде могут быть белки, пептиды, аминокислоты, соли аммония или аммиака, нитраты, а также атмосферный азот. Азот может содержаться в форме неорганических солей или кислот. Большинство дрожжей хорошо усваивает аммиачные соли, а также аммиак из водного раствора, потребность в нитратах испытывают только некоторые виды дрожжей. Количество азотсодержащих веществ для образования биомассы можно вычислить, если известно содержание азота в данной биомассе и вероятный урожай ее. Обычно принимают, что 5% азота остается в питательной среде неиспользованным.

Источники фосфора. Фосфор является важнейшим компонентом клетки. Он входит в состав АТФ (аденозинтрифосфата), АДФ, АМФ и тем самым обеспечивает нормальное течение энергетического обмена в клетке, а также синтез белков, нуклеиновых кислот и другие процессы биосинтеза. Фосфор вносят в среду в виде солей фосфорной кислоты.

Источники витаминов и микроэлементов. Потребность микроорганизмов в этих соединениях различна, тем не менее, практически все микроорганизмы лучше растут в присутствии витаминов. Эффективной добавкой к питательным средам оказался кукурузный экстракт благодаря наличию в нем витаминов, аминокислот и минеральных элементов в легко ассимилируемых формах. Микроэлементы в состав питательных сред вводят в микродозах, в противном случае они оказывают ингибирующее действие на микробные клетки.

Ингибирующие вещества также влияют на рост и биосинтез микробных культур, которые в соответствии с механизмом действия подразделяются на несколько групп:

• вещества, приводящие к повреждению поверхностных клеточных структур. Например, 70 %-й этанол коагулирует белки, оказывая бактерицидное действие. Фенолы, крезолы, нейтральные мыла и различные ПАВ нарушают избирательную проницаемость цито-плазматической мембраны. С детергентами сходны по своему действию некоторые полипептидные антибиотики (полимиксин, бацитрацин, субтилин, низин);

• вещества, действующие как ферментные яды и нарушающие нормальный метаболизм (например, тяжелые металлы – медь, ртуть, свинец). Они связываются с SH-группами белков, нарушая их пространственную структуру. Цианид и СО действуют как дыхательные яды, блокируя цитохромоксидазы. 2,4-динитрофенол является разобщителем процессов окисления и фосфорилирования. Арсенат ингибирует субстратное фосфорилирование. Антимицин А нарушает процесс перенос электронов по дыхательной цепи, ингибируя цитохром с-редуктазу. Фторацетат блокирует работу цикла три карбоновых кислот;

• аналоги нормальных метаболитов, которые конкурируют с ними за каталитический центр фермента. Например, на этом основано лекарственное действие сульфаниламидных препаратов. При включении структурного аналога (сульфаниламида) образуется нефункционирующий фермент и рост бактерий останавливается;

• вещества, нарушающие нормальные процессы синтеза полимеров. Например, на белковый синтез действуют антибиотики стрептомицин и неомицин (подавляют связывание аминокислот между собой), эритромицин (нарушает функции 50S-субъединицы рибосом), тетрациклин (препятствует связыванию аминоацил-тРНК с рибосомами), хлорамфеникол (подавляет функцию пептидилтрансферазы). Некоторые антибиотики подавляют синтез нуклеиновых кислот (митомицин С, актиномицин Д, рифампицин). Пенициллин и ряд других антибиотиков подавляют синтез пептидогликана.

Концентрация питательной среды. Дозировки природных продуктов в среду необходимо регулировать в соответствии с оптимальными границами концентраций наиболее важных активных веществ для данной культуры. Если на клетки микроорганизмов воздействуют слишком высокие концентрации веществ в растворе, может произойти плазмолиз – часть воды выйдет из клеток и протоплазма отойдет от клеточной стенки. Это явление можно наблюдать если, например, поместить дрожжевые клетки в каплю 2 – 5 %-ного раствора NaCl. Большинство бактерий легко переносят 0,5 – 3 %-ную концентрацию солей, а галофильные микроорганизмы выдерживают даже 29 %-ную концентрацию. Следует отметить, что по осмотической активности 20 %-ный раствор соли эквивалентен 60 %-ному раствору сахара, т. е. поваренная соль осмотически в 3 раза активней.

Окислительно-восстановительный потенциал питательной среды. Большое значение в жизни микроорганизмов имеет кислород. Степень аэробности среды (насыщения среды кислородом) может быть охарактеризована величиной окислительно-восстановительного потенциала, который выражают в единицах rН₂. В среде, окислительные свойства которой соответствуют насыщению среды кислородом rН₂ = 41. В среде с высокими восстановительными условиями rН₂ = 0. При равновесии окислительных и восстановительных процессов rН₂ = 28.

Облигатные анаэробы (микроорганизмы, для которых кислород является ядом) живут при rН₂ меньше 12 – 14, но размножаются при rH₂ менее 3 –5. Факультативные анаэробы (микроорганизмы, способные расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях) развиваются при rH₂ от 0 до 20 – 30, а аэробы – при rН₂ от 12 – 15 до 30.

Регулируя окислительно-восстановительные условия среды, можно затормозить или вызвать активное развитие той или иной группы микроорганизмов. Например, в виноделии для предотвращения развития уксуснокислых бактерий емкости с вином нужно заполнять полностью, чтобы снизить степень насыщения среды кислородом.

Потребление кислорода в среде зависит от концентрации клеток. Чем она выше, тем больше требуется кислорода. Выбирая режим аэрации, надо обеспечить такую скорость растворения кислорода, которая полностью соответствовала бы его расходу.

Обеспечивая культуру аэробных микроорганизмов кислородом, надо добиться его максимального растворения в среде. Как известно, при давлении 0,1 МПа (1 кгс/см²) и температуре 30 °С в 1 л дистиллированной воды максимально возможное количество растворенного кислорода равно 7,54 мг.

Промежуточное положение занимают факультативно анаэробные микроорганизмы, например спиртовые дрожжи, способные в зависимости от условий аэрирования переходить от процесса дыхания (энергетически выгодный процесс) на другой способ получения энергии – спиртовое брожение. Данное свойство дрожжей носит название «пастеровский эффект» и широко используется на практике. При производстве хлебопекарных и кормовых дрожжей среду интенсивно аэрируют, продувая за 1 мин через каждую единицу объема среды 1 – 2 ед. объема воздуха. В спиртовом производстве рост дрожжевых клеток ограничивают созданием анаэробных условий, что в свою очередь приводит к интенсификации процесса спиртового брожения. Примером анаэробных микроорганизмов могут служить метанокисляющие бактерии, используемые для биосинтеза витамина В₁₂, при культивировании которых в начале процесса ферментации через культуралъную жидкость продувают СО₂ для деаэрации и перемешивания.

Температура среды. Большинство используемых в промышленности микроорганизмов по отношению к температуре являются мезофилами: их развитие происходит при 25 – 37 °С. Психрофилъные микроорганизмы растут в интервале 0 – 15 °С, а термофильные – в интервале 55 – 75 °С. Все перечисленные группы имеют промежуточные формы. Обычно при повышении температуры процессы био­синтеза интенсифицируются, если это повышение не ингибирует ключевые ферменты биосинтез.

Концентрации водородных ионов (рН среды). В микробиологическом синтезе большое значение имеет реакция среды. Для каждой культуры микроорганизмов есть свой оптимум, максимум и минимум рН. Ацидофильным микроорганизмам (некоторые дрожжи, плесени, бактерии) необходим рН 1,5 – 4,5, нейтрофильным – рН 6,5 – 8,0, базофильным – рН 8,5 – 9,5. Большинство микроорганизмов лучше всего развивается в нейтральной среде при рН 7,0. Если рН не соответствует оптимальной величине, то микроорганизмы не могут нормально развиваться, так как активная кислотность оказывает влияние на активность ферментов клетки и проницаемость цитоплазматической мембраны. Некоторые микроорганизмы, образуя продукты обмена и выделяя их в среду, способны изменять реакцию среды, что необходимо учитывать при промышленном выращивании микроорганизмов.

Стерильность питательной среды также оказывает значительное влияние на эффективность культивирования, поскольку не только обеспечивает уничтожение патогенной микрофлоры, но и исключает антагонистические отношения между штаммами. Стерильность обеспечивают, обрабатывая соответствующий объект физическими (температура, облучение, фильтрация) или химическими средствами.