5.2.2. Подготовка посевного материала

В биотехнологии широко применяются плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты (грамположительные бактерии, не образующие спор), бактерии и водоросли в виде чистых и смешанных культур. В традиционных процессах ферментации предпочтение обычно отдается смешанным культурам, а в большинстве современных ферментационных процессов – монокультурам (чистым культурам), выращиваемых в асептических условиях. Большинство используемых сегодня культур получено из природных источников, однако затем эти культуры были улучшены или путем выращивания в условиях, характерных для данного процесса (для повышения выхода биомассы и первичных метаболитов), или с помощью мутагенеза или генетической инженерии (для производства вторичных метаболитов).

Посевным материалом (инокулятом) называют чистую культуру микроорганизма, которую получают путем ее последовательного пересева из пробирки в колбу, а затем в аппараты увеличивающегося объема до количества, необходимого для промышленного производства.

Хранение чистой культуры. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента – ключевая задача любого биотехнологического производства. Культуры микроорганизмов-продуцентов заводы получают из коллекций в пробирках на агаризованных питательных средах или в ампулах. Чистая культура микроорганизма может постоянно или по мере необходимости использоваться в производстве. При длительном хранении чистых культур могут происходить случайные нерегулируемые мутации. Для избежания мутаций следует не только соблюдать правила хранения и поддержания исходной культуры, но и периодически проводить пересев культуры и проверку ее однородности как по морфологическим, так и по физиологическим признакам.

На практике культуры хранят различными способами:

• на косом агаре при низкой температуре (1 – 5 °С) можно хранить культуру 1 – 2 мес;

• замораживание и хранение при температуре ниже – 20 °С позволяет сохранить культуру в течение нескольких месяцев, при условии строгого сохранения температурных режимов хранения;

• на твердых средах под слоем стерильного парафина или минерального масла можно хранить дрожжи, плесневые грибы –менее пригоден этот способ для хранения актиномицетов. Масло предохраняет культуру от высыхания идоступа кислорода;

• на агаре без добавления питательных веществ (допускаются очень незначительные добавки питательных веществ);

• лиофилизирование (культуру замораживают при температуре до – 80 °С (обычно при – 30 °С) и подвергают сублимации в вакууме. При этом происходит сублимация превратившейся в лед свободной воды или воды, непрочно связанной с гидрофильными веществами. Лед переходит из твердого состояния в парообразное, минуя жидкую фазу. Для предохраненияклеток от инактивации используют защитные среды (сыворотка крови, бульон, сахароза, смесь песка и глины и др.). Лиофилизированную чистую культуру в ампулах хранят в течение нескольких лет;

• хранение в стерильной смеси песка и глины заключается в следующем.Нанесенные на эту смесь микроорганизмы или суспензию спор сушат прикомнатной температуре и при такой же температуре хранят в посуде, закрытойватной пробкой.

Приготовление посевного материала состоит из следующих этапов:

1. Получение культуры микроорганизма в микробиологической лаборатории завода.

2. Выращивание микроорганизмов в малом посевном аппарате.

3. Выращивание микроорганизмов в большом посевном аппарате.

4. Накопление культуры микроорганизмов в малом ферментере.

Передачу чистых культур из одного аппарата в другой осуществляют в конце логарифмической фазы роста. Качество полученного посевного материала контролируют путем микроскопирования.

Лабораторная стадия. Перед началом технологического процесса культуру размножают в лаборатории в стерильных условиях при оптимальном составе среды и режиме выращивания (рН, температура, длительность). С поверхности косого агара культуру стерильно переносят в колбы объемом 100 – 200 мл и инкубируют. Длительность каждой стадии выращивания 24 ч. Содержимое колб используют в качестве посевного материала для первого инокулятора цеха чистой культуры.

Иногда для уменьшения опасности заражения инфекцией в инокулятор культуру вносят прямо из пробирок. При этом длительность инокуляции увеличивается.

В производстве антибиотиков часто используют споровый материал. При этом в лабораторных условиях культуру размножают двумя способами:

• культуру продуцента высевают на косой агар, инкубируют до образования спор и смывают их стерильной водой. Суспензию спор снова переносят в свежую агаризированную среду для получения спорового материала второго поколения. Выросшие споры еще раз смывают стерильной водой и суспензию используют для получения первого вегетативного поколения продуцента на жидкой среде;

• культуру продуцента высевают на агаризованную среду для получения спор. Полученную суспензию спор сразу же вносят в колбы с жидкой средой и выращивают их на качалке. Полученный таким образом вегетативный материал продуцента первого поколения используют в качестве посевного материала для второго поколения продуцента в колбах с жидкой средой. Вегетативный материал второго поколения используют для внесения в инокулятор.

Инокуляционная стадия. Дальнейшее размножение посевного материала обычно идет в две стадии: в цехе чистой культуры и в отделе инокуляции.

Для приготовления посевного материала используют полноценную среду, тщательно проверенную различными химическими и микробиологическими методами. Культивирование микроорганизмов на питательной среде основного состава позволяет культуре быстро адаптироваться к окружающим условиям и компонентам питательной среды, при этом происходит активация ферментов, а также синтезируются новые ферментные системы. Количество питательной среды в аппарате не должно превышать 60 % общего объема Продолжительность приготовления посевного материала на этой стадии обычно не превышает 1 сут. Посевной материал для главной ферментации готовят в количестве 5 – 20 % объема используемой питательной среды.

Подготовленный посевной материал направляют на культивирование.