Приборы, методы и среды для культивирования анаэробов
Микроанаэростат – используется для создания вакуума с дозированным содержанием кислорода. Прибор представляет собой герметически закрывающийся сосуд, снабжённый манометром, в который помещают посевы и откачивают воздух. Микроанаэростат помещают в термостат.
Эксикатор – стеклянный лабораторный сосуд с притёртой крышкой. В его донной части имеется дополнительная емкость, куда наливается смесь пирогаллола и едкого натра или гидросульфита натрия и двууглекислой соды. На сетку-подставку помещают посевы и притирают крышку с помощью вазелина. Эксикатор помещают в термостат.
Метод Фортнера. В чашку Петри наливают питательный агар с 1-2% глюкозы. Посредине чашки стерильным скальпелем вырезают канавку шириной приблизительно 1 см. Одну половину чашки засевают культурой аэробов (сарцина, кишечная палочка), вторую – культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом. Засеянную чашку закрывают, герметизируют и помещают вверх дном в термостат. Быстрорастущие аэробы, поглощая кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробных микроорганизмов.
Метод Перетца. В стерильную чашку Петри помещают стеклянные палочки, на которые кладут стеклянные пластинки или предметные стекла. В пробирку с 20 мл расплавленного и охлажденного до 500С МПА с 10% глюкозы (pH 7,0-7,2) вносят исследуемый материал и добавляют 2-4 капли 10% гидросульфита натрия на 10% растворе углекислой соды. Содержимое пробирки быстро перемешивают и выливают в чашку с таким расчётом, чтобы агар заполнил пространство между стеклянной пластинкой и дном чашки. Чашки инкубируют при 370С 24-48 часов. Колонии анаэробов вырастают под стеклянной пластинкой.
Метод Вейон-Виньяля. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до 40-450С сахарным агаром вносят исследуемый материал и перемешивают. При необходимости материал разводят путём переноса в последующие 2-3 пробирки с расплавленным агаром. Содержимое пробирок набирают в пастеровские пипетки. После заполнения пипетки вытянутый конец запаивают, а противоположный конец закрывают стерильной ваткой и заливают парафином. Трубки помещают в термостат; через 2-3 суток в агаре вырастают глубинные колонии, видимые в проходящем свете, которые можно изолировать. Для этого трубку надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию извлекают петлёй и пересевают для накопления чистой культуры в соответствующую питательную среду.
Метод Биттнера. К крышке чашки Петри с посевом исследуемого материала или выделенной культуры анаэробов прикрепляют пакет из фильтровальной бумаги, содержащей пирогаллол, К2СО3 и тальк. Чашку герметизируют при помощи парафина или скотча. Содержимое пакета увлажняется за счёт образующегося конденсата, и ингредиенты вступают в реакцию, которая сопровождается поглощением О2 и выделением СО2.
Газ-пак (Generbaganaer). Система Generbaganaer состоит из воздухонепроницаемых пакетов, изготовленных из прозрачной пластмассы и генераторов, содержащих смесь веществ, поглощающих кислород. Последовательность работы: вынуть генератор из пакета, поместить в нижнюю часть воздухонепроницаемого пакета, затем поместить чашки (или пробирки) с посевами и с помощью специальной скрепки закрыть пакет. Инкубация при 370С.
Среда Китта-Тароцци. Содержит мясо-пептонный бульон, 0,5% глюкозы и 0,15% агара. На дно пробирки для адсорбции О2 помещают кусочки варёной печени или фарша слоем 1-1,5 см и заливают 6-7 мл среды. Среду перед посевом регенерируют (прогревают 15-20 мин. на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают). После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.
Полужидкий сахарный агар (высокий столбик). В пробирку с 6-7 мл расплавленного и охлаждённого до 40-450С полужидкого питательного агара, содержащего 0,5-1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.
Среда для контроля стерильности (СКС). Рост многих анаэробных микроорганизмов возможен только на средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. Поэтому в среды добавляют восстановители, например, тиогликолевую кислоту или её натриевую соль, цистеин, аскорбиновую кислоту. Функции восстановителей выполняют и другие компоненты среды: глюкоза, пептон. СКС содержит питательный бульон, витаминный препарат ЭКД, NaCl, Na2CO3, глюкозу, тиогликолят натрия, цистеин, агар (0,75%). Среду разливают в пробирки по 6-7 мл.
Выделение чистой культуры бактерий - аэробов из материала, содержащего смесь микробов, занимаеткак правило 3 дня и производится по следующей схеме:
1 день - микроскопия мазка из исследуемого материала, окрашенного по Граму - для предварительного ознакомления с микрофлорой данной смеси. Посев материала петлёй на чашку Петри с питательной средой штриховым методом для получения изолированных колоний. Засеянные чашки помещают в термостат на сутки.
2 день - изучение колоний, выросших на чашках, отбор изолированных колоний, описание их и микроскопия мазков из изолированных колоний (окраска по Граму) для проверки однородности микробов в колонии. Пересев изолированной колонии на скошенный агар для получения чистой культуры. Посевы помещают в термостат на сутки.
3 день - проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре, путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным.
- Государственное бюджетное образовательное учреждние высшего профессионального образования
- Методические указания к самостоятельной подготовке студента.
- План практических занятий.
- Основная литература
- Дополнительная литература
- Периодические издания
- Электронное информационное обеспечение и Интернет-ресурсы.
- Занятие 1
- План изучения темы.
- После изучения темы студент должен уметь.
- Правила для студентов, работающих на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии.
- Обязанности дежурного.
- Дополнительный материал к занятию. Правила микроскопии с иммерсионной системой.
- Приготовление фиксированных препаратов из культур микроорганизмов.
- Техника окраска по Граму в модификации Синёва.
- Отношение бактерий к окраске по Граму.
- Окраска по Цилю-Нильсену.
- Контрольные вопросы.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 2
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 3
- После изучения темы студент должен уметь.
- Контрольные вопросы.
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 4
- Контрольные вопросы по разделу «Морфология микробов» (подробную расшифровку вопросов смотрите в занятиях 1-3).
- Работа студента на практическом занятии.
- Методы выделения чистых культур бактерий
- Техника посева микроорганизмов на питательные среды
- Приборы, методы и среды для культивирования анаэробов
- Контрольные вопросы.
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 6
- После изучения темы студент должен уметь.
- Дополнительный материал к занятию. Методы стерилизации
- Методы контроля стерильности.
- Методы частичного обеспложивания.
- Контрольные вопросы.
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 7
- Дополнительный материал к занятию.
- Методы проведения санитарно-микробиологических исследований
- Допустимые уровни бактериальной обсеменённости воздушной среды помещений лечебных учреждений в зависимости от их функционального назначения и класса чистоты
- Контрольные вопросы.
- Задание на самостоятельную работу.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 8
- Контрольные вопросы.
- Контрольные практические задания по разделу «Физиология микробов.
- Работа студента на практическом занятии.
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Работа студента на практическом занятии.
- Запись в тетради
- План изучения темы.
- После изучения темы студент должен уметь.
- Контрольные вопросы.
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 11
- Контрольные вопросы.
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 12
- Контрольные вопросы.
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Занятие 13
- Работа студента на практическом занятии.
- Контрольные вопросы.
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 15
- Применение бактериофагов.
- Контрольные вопросы.
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 16
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 17
- Контрольные вопросы.
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 18
- План изучения темы.
- После изучения темы студент должен уметь.
- Дополнительный материал к занятию Микробиологические методы идентификации микробов рода Staphylococcus
- Контрольные вопросы.
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 19
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 20
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 21
- Цель самоподготовки
- Контрольные вопросы по разделу
- Занятие 23
- Методы определения вида и типа вирусов
- Контрольные вопросы
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Самостоятельная работа студента на практическом занятии
- Занятие 24
- План изучения темы.
- После изучения темы студент должен уметь.
- Контрольные вопросы.
- Задания для выполнения в процессе самоподготовки.
- Работа студента на практическом занятии.
- Занятие 25
- Задания для самостоятельной работы.
- Задание для самостоятельной работы.
- Задание для самостоятельной работы.
- Задание для самостоятельной работы.
- Задания для самостоятельной работы.
- Работа студентов на практическом занятии.
- Занятие 30
- Занятие 31
- Занятие 32
- Работа студента на практическом занятии