8.1.2. Производство витаминов

Витамины (от лат vita – жизнь) – «амины жизни» – низкомолекулярные органические соединения, которые, присутствуя в малых количествах, обеспечивают нормальное протекание биохимических процессов. Витамины – незаменимые факторы питания.

Изучение физиологии и генетики микроорганизмов – продуцентов витаминов, выяснение путей биосинтеза каждого из них позволили создать теоретические основы получения микробиологическим способом практически всех известных витаминов. Однако биотехнологическими методами целесообразнее производить лишь особо сложные по строению витамины: В₂, В₁₂, β-каротин и предшественники витамина D. Остальные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем.

Получение витамина В₂ (рибофлавин). Вплоть до 30-х годов прошлого столетия рибофлавин выделяли из природного сырья. В наибольшей концентрации он присутствует в моркови и печени трески. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени – 6 г. В 1935 г. обнаружен активный продуцент рибофлавина – гриб Eremothecium ashbyii, способный при выращивании на 1 т питательной смеси синтезировать 25 кг витамина В₂. Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В₂, флавиновыми нуклеотидами, а также изменением состава культуральной среды. Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В₂ – розеофлавину.

Технология получения. В состав среды для роста продуцентов витамина В₂ входят соевая мука, кукурузный экстракт, сахароза, карбонат кальция, хлорид натрия, гидрофосфат калия, витамины, технический жир. Грибы чувствительны к изменению состава среды и подвержены инфицированию. Перед подачей в ферментер среду подвергают стерилизации, добавляя к ней антибиотики и антисептики.

В качестве посевного материала используют споры Е. ashbyii. Процесс ферментации грибов для получения кормового рибофлавина длится 3 суток при температуре 28 – 30 °С. Концентрация рибофлавина в культуральной жидкости может достигать 1,4 мг/мл. По завершении процесса ферментации культуральную жидкость концентрируют в вакууме, высушивают на распылительной сушилке (влажность 5 – 10 %) и смешивают с наполнителями.

Методами генной инженерии сконструирован рекомбинантный штамм продуцента Bacillus subtilis, характеризующийся увеличенной дозой оперонов, которые контролируют синтез рибофлавина и способный синтезировать втрое больше по сравнению с Е. ashbyii количество рибофлавина за 40 ч ферментации.

Получение витамина В₁₂. Витамин В₁₂ открыт в 1948 г. одновременно в США и Англии. Первоначально витамин В₁₂ получали исключительно из природного сырья, но из 1 т печени можно было выделить всего лишь 15 мг витамина. В 1972 г. в Гарвардском университете был осуществлен химический синтез предшественника витамина В₁₂. Химический синтез корнестерона – структурного элемента корринового кольца витамина, включающий 37 стадий, в крупных масштабах не воспроизведен из-за сложности процесса. Учитывая важную функцию витамина в организме человека (он является противоанемическим фактором), его мировое производство достигло 10 т в год, из которых 6,5 т расходуют на медицинские нужды, а 3,5 т – в животноводстве.

Единственный способ получения витамина В₁₂ в настоящее время – микробиологический синтез. Его продуцентами являются прокариоты и, прежде всего, пропионовые бактерии, которые и в естественных условиях образуют этот витамин. Выделено 14 видов пропионовокислых бактерий, продуцирующих витамин В12. Мутанты Propionibacterium shermanii и Pseudomonas denitrificans продуцируют в жидкой среде до 58 – 59 мг/л цианкобаламина.

Технология получения. Для получения высокоочищенных препаратов витамина В₁₂ пропионовокислые бактерии культивируют периодическим способом без доступа кислорода на средах, содержащих глюкозу, казеиновый гидролизат, витамины, неорганические соли, хлорид кобальта. Уровень рН ферментационной среды поддерживают около 7,0 добавлением NH₄OH; продолжительность ферментации 6 суток; через 3 суток в среду добавляют 5,6-диметилбензимидазол. Добавление в среду предшественника 5,6-диметилбензимидазола по окончании первой ростовой фазы (5 – 6 суток) стимулирует быстрый (18 – 24 ч) синтез витамина с выходом последнего до 30 мг/л.

Цианкобаламин накапливается в клетках бактерий, поэтому операции по выделению витамина заключаются в следующем: сепарирование клеток, экстрагирование водой при рН 4,5 – 5,0 и температуре 85 – 90 ^оС, в присутствии стабилизатора (0,25 % раствор натрия нитрита), Экстракция протекает в течение часа, после чего водный раствор охлаждают, нейтрализуют раствором едкого натрия, добавляют коагулянты белка – хлорид железа трехвалентного и алюминия сульфат с последующим фильтрованием. Фильтрат упаривают и дополнительно очищают, используя методы ионного обмена и хроматографии, после чего проводят кристаллизацию витамина при 3 – 4 ^оС из в одноацетонового раствора.

При реализации данного биотехнологического процесса не забывать о высокой светочувствительности витамина В₁₂, поэтому все операции необходимо проводить в затемненных условиях (или при красном свете).

Получение β-каротина. β-Каротин – это изопреноидные соединения, из одной молекулы β-каротина при гидролизе образуются две молекулы витамина A. Каротиноиды можно выделить из ряда растительных объектов – моркови, тыквы, облепихи, люцерны, а также они синтезируются многими пигментными микроорганизмами из родов Aleuria, Blakeslea, Corynebacterium, Flexibacter, Fusarium, Halobacterium, Phycomyces, Pseudomonas, Rhodotorula, Sarcina, Sporobolomyces и др. Характерно, что содержание β-каротина у микроорганизмов во много раз превышает содержание этого провитамина у растений. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг, в то время как в 1 г биомассы гриба Blaneslea trispora – 3 – 8 тыс. мкг.

Каротиноиды локализуются в виде сложных эфиров и гликозидов в клеточной мембране микроорганизмов, либо в гранулах цитоплазмы.

Технология получения. Питательные среды для производства β-каротина включают источники углерода, азота, витаминов, микроэлементов, специальных стимуляторов (кукурузно-соевая мука, растительные масла, керосин, -ионон или изопреновые димеры). В качестве продуцентов каротиноидов можно использовать бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы. Более часто применяют зигомицеты Blakeslea trispora и Choanephora conjuncta. При совместном культивировании штаммы этих видов могут образовать 3 – 4 г каротина на 1 л среды. Па первом этапе получения каротиноидов штаммы культивируют раздельно, а затем – совместно при 26 ^оС и усиленной аэрации с последующим переносом в основной ферментатор. Длительность ферментации – 6 – 7 дней. Каротиноиды извлекают ацетоном или другим неполярным растворителем. В целях очистки и более тонкого разделения используют методы хроматографии. Витамин A из β-каротина сравнительно легко можно получить при гидролизе.

Получение витамина D₂. Витамин D – это группа родственных соединений, в основе которых находится эргостерин, который обнаружен в клеточных мембранах эукариот. Содержание эргостерина в дрожжевых клетках колеблется в пределах 0,2 – 11 %. Кроме дрожжей продуцентами эрогостерина могут быть мицелиальные грибы – аспергиллы и пенициллы, в которых содержится 1,2 – 2,2 % эргостерина. Трансформация эргостерина в витамин D₂ (кальциферол) происходит под влиянием ультрафиолетового облучения. При этом разрывается связь в кольце (позиции 9,10) и образуется двойная связь в боковой цепочке (позиции 22, 23).

Технология получения. В качестве продуцентов эргостерина микробиологическим способом используют культуры дрожжей, которые получают на средах, обеспечивающих полноценное развитие клеток. Основная среда содержит источник углерода и пониженное количество азота (высокое значение C/N), обогащается ацетатом (активатором биосинтеза стеринов). Культивирование дрожжей проводят при температуре, близкой к оптимальной для конкретного штамма, и выраженной аэрации. Спустя 3 – 4 суток, в зависимости от ростовых характеристик и биосинтетической активности культуры, клетки сепарируют и подвергают вакуум-высушиванию. Затем сухие дрожжи облучают ультрафиолетовыми лучами – УФЛ (длина волны 280 – 300 нм) в течение оптимального по продолжительности времени. Облучение дрожжей можно проводить до сепарирования клеток в тонком слое 5 % суспензии, учитывая малую проникающую способность УФЛ.

Облученные сухие дрожжи применяют в животноводстве; в промышленности их выпускают под названием «кормовые гидролизные дрожжи, обогащенные витамином D₂». В таком препарате содержится не менее 46 % сырого белка, незаменимые аминокислоты (лизин, метионин, триптофан) и 5000 ME витамина D₂ в 1 г.

В случае получения кристаллического витамина D₂ клетки продуцента гидролизуют соляной кислотой при 110 ^оС, затем температуру снижают до 75 – 78 ^оС и добавляют этанол. Спиртовой экстракт упаривают до 70 %-го содержания сухих веществ. Полученный «липидный концентрат» обрабатывают раствором едкого натрия. Эргостерин кристаллизуется из неомыленнной фракции концентрата при 0 ^оС. Его очищают повторной перекристаллизацией. Кристаллы высушивают, растворяют в серном эфире, облучают УФЛ, эфир отгоняют, раствор витамина D₂ концентрируют и кристаллизуют.