3.3. Типы мутантных штаммов продуцентов

Для биотехнологических целей все больше используют мутантные и генетически измененные микроорганизмы. Одна из задач биотехнологии состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктов метаболизма, что достигается путем изменения генетической программы организма и (или) посредством нарушения регуляторных систем метаболизма в нем.

Ауксотрофные мутанты – мутантные штаммы микроорганизмов, не способные к синтезу определенных ферментов, т.е. мутанты с ограниченной способностью к образованию конечных продуктов. Такие объекты биотехнологического процесса нечувствительны к концентрации конечного продукта за счет обхода механизма ретроингибирования.

Выключение механизма ретроингибирования возможно, если мутации у микроорганизмов вызывают разрыв в последовательности биохимических реакций образования конечного продукта. Из-за отсутствия фермента, катализирующего промежуточную стадию процесса, в среде накапливается не конечный продукт, а промежуточный целевой метаболит.

Благодаря отсутствию ингибитора (конечного продукта) использование субстрата и рост микроорганизма продолжаются, но лишь при условии добавления в среду в лимитирующих количествах вещества – продукта блокированной реакции:

Ф

А → В → С → Д → Е

В – промежуточный целевой метаболит; Ф – фермент катализирующий промежуточную стадию; Д – продукт блокированной реакции; Е – аллостерический ингибитор

Для отбора мутантов с дефектами экспрессии генов и регуляции обмена веществ использую методы селекции. Один из них состоит в получении мутантов, устойчивых к структурным аналогам целевого продукта. Отбор продуцентов проводят на селективной среде, содержащей подходящий аналог целевого продукта, которые не включаются в обмен веществ (в частности, аналоги аминокислот не включаются в состав белков), что ведет к подавлению роста организма. Выжившие мутанты обладают дефектами в механизме регуляции активности фермента по принципу обратной связи.

Рекомбинантные мутанты. Принципиально другая группа мутантных продуцентов может быть получена благодаря достижениям в области молекулярной биологии и молекулярной генетики, позволяющие перейти от слепого отбора штаммов мутантов к сознательному конструированию геномов, используя для этой цели технологию рекомбинантной ДНК.

Уровень экспрессии структурных генов в той или иной степени может быть изменен в результате мутаций, осуществляемых по различным участкам оперона.

Мутации в гене-регуляторе проводят таким образом, чтобы его продукт – белок-репрессор – утрачивал способность связываться с оператором. В результате мутаций исчезает эффект катаболитной экспрессии, а индуцибельные ферменты становятся конститутивными, т. е. их экспрессия не зависит от присутствия в среде субстрата. Мутанты с дефектами регуляторной области оперона называются регуляторными, их функция – биосинтез конститутивных ферментов.

Мутации в нуклеотидных последовательностях зоны гена-оператора приводят к тому, что такие операторы не могут связывать нормальный репрессор и также приобретают способность к конститутивной экспрессии структурных генов.

Мутации по участкам гена, влияющим на структуру аллостерического центра фермента, могут привести к изменениям в конформации белка, которые делают молекулу энзима нечувствительной к концентрации конечного продукта. Это обеспечивает возможность образования в клетке избыточного количества целевого продукта.

На практике получение таких мутантов означает создание (in vitro) искусственных генетических программ методами генетической инженерии.