Глава 4. Оксид азота как регулятор клеточных функций

Оксид азота (NO^.) – соединение, находящееся в нормальных условиях в газообразном состоянии. Он входит в состав продуктов сгорания ископаемого топлива, тления табака, участвует в фотохимическом образовании смога. В 1986 году оксид азота был идентифицирован как эндотелиальный фактор релаксации сосудов (ЭФР), а в дальнейшем как медиатора нервной, иммунной и других систем организма, что открыло новые перспективы в понимании механизмов нормальной и патофизиологической функции данного соединения. Экспоненциальный рост публикаций по исследованию роли NO^- в биологических системах (за 20-летний период публикаций свыше 40 тыс.статей) позволил Американской Ассоциации развития науки назвать в 1992 году NO^- молекулой года. Открытие и изучение роли NO^- как высокоэффективного регулятора в сердечно-сосудистой системе было отмечено в 1998 году Нобелевской премией в области физиологии и медицины, которой были удостоены американские исследователи Роберт Ферчготт, Ферид Мурад и Льис Игнарро.

Оксид азота – нетипичная сигнальная молекула: она газообразна, имеет неспаренный электрон на внешней разрыхляющей -орбитали, что придает NO^- высокую реакционную способность. NO^- легко окисляется и восстанавливается с образованием иона нитрозония (NO⁺) или нитроксил-аниона NO^-. NO^- хорошо растворим в воде. Будучи неполярным соединением, оксид азота легко диффундирует через липидный бислой мембран и мигрирует в биологических средах, является достаточно долгоживущим (среднее время жизни в биосистемах 5,6 с), после чего при участии кислорода и воды он превращается в нитриты и нитраты. Оксид азота образует стабильные комплексы с гемоглобином (нитрозил-гемоглобин) – HbNO и вступает в реакции S-нитрозилирования с сывороточным альбумином и другими SH-содержащими соединениями (глутатионом, гемоглобином) с образованием S-нитрозотиолов (RSNO, GSNO, SNOHb). В виде комплексов оксид азота транспортируется в организме и может реагировать в биосистемах с кислородом, супероксидным анион-радикалом (О₂^. ), ионами металлов переменной валентности.

В связи с этим функциональный ответ клетки на действие NO^. Многообразен и в значительной степени зависит не только от фенотипа клетки-мишени, а также от количества NO в клетке, редокс-состояния NO^. и его микроокружения. Установлено, что молекулы NO^. синтезируются под действием фермента NO-синтазы (NOS) во многих клетках организма.

Оксид азота – аутокринная сигнальная молекула, так как участвует в проведении сигнала от мембранных рецепторов к молекулам внутрь клетки по гуанилатциклазному пути.

Оксид азота – паракринный эффектор, вносит вклад в согласованную работу близлежащих клеток, создавая «поле воздействия».

Оксид азота отвечает за широкий диапазон физиологических функций:

- регуляцию тонуса сосудов (эндотелиальный фактор релаксации);

- межклеточную коммуникацию;

- является нейромедиатором нового типа, участвует в модуляции нейротрансмиссии;

- участвует в регуляции иммунной цитотоксичности, осуществляя противораковое и бактерицидное действие;

- секрецию медиаторов и гормонов;

- экспрессию генов;

- регуляцию функции митохондрий;

- индукцию и ингибирование апоптоза.

Оксид азота – потенциально токсичная молекула, которая участвует во многих патологических процессах: гипертензии, сахарном диабете, сердечной недостаточности, канцерогенезе, наркомании, атеросклерозе, циррозе печени, нейродегенеративных болезнях, мужской импотенции и др.

Биосинтез оксида азота.

Оксид азота образуется в результате окисления кислородом гуанидиновой группы L-аргинина при участии фермента NO-синтазы (NOS), в реакции образуется также L-цитруллин:

_{NOS:NADFH, FAD}

L-аргинин + О₂ → L-цитруллин + NO^.

^{FM, ВH4, гем}

В процессе биосинтеза NO^. участвует 5 электронов. По своему механизму реакция является монооксигеназной, в ходе которой один атом кислорода включается в молекулу субстрата (NO^. ). При этом образуется промежуточный продукт N-гидрокси-L-аргинин. Для активности NOS необходимы кальций-связывающий белок кальмодулин (СаМ), а также коферменты и простетические группы: тетрагидроптерин (ВН₄), НАДФН, ФАД, ФМН, гем с пентакоординированным Fe³⁺, Zn²⁺. NOS- это флавогемопротеин. В молекуле фермента выделяют 2 домена: оксигеназный (гемовый) домен на N-конце и редуктазный домен на С-конце.

Редуктазный домен включается в транспорт электронов от НАДФН:

НАДФН → ФАД → ФМН → гем (Fe³⁺)

Перенос электронов между ФАД и ФМН необходим для генерации стабильного флавинсемихинонного радикала и для восстановления гемопротеина (Fe³⁺→ Fe²⁺). В оксигеназном домене находится центр для связывания L-аргинина, происходит активация кислорода (О₂→ О₂^. ) и окисление гуанидинового азота аргинина с образованием NO^. и цитруллина.

Между доменами находится центр для связывания СаМ, без которого NOS неактивна и который определяет субклеточную локализацию фермента. ВН₄ необходим для формирования нативной структуры фермента и для сближения кислорода, железа гема и гуанидиновой группы аргинина. NOS является гомодимером и связывание Zn²⁺ обязательно для образования димерной молекулы фермента. Работа фермента зависит от концентрации Са²⁺. Комплекс Са²⁺-СаМ включен в контроль переноса электронов между флавиновыми простетическими группами и гемом в оксигеназном домене.

Рис. 14. Структурная организация нейрональной NO-синтазы

NOS – это семейство ферментов, образующих NO обнаружено во всех тканях и клетках. В настоящее время выделены и охарактеризованы три изоформы NOS. Две из них коститутивные (стационарные): нейрональная – nNOS (NOSI) и эндотелиальная – eNOS (NOSIII). Обнаружена еще индуцибельная форма – iNOS (NOSII).

Таблица 4

Физико-химическая характеристика NO-синтаз млекопитающих

В разобщенной реакции в зависимости от недостатка субстрата NOS продуцирует в дополнение к NO^. активные формы кислорода – супероксид (О₂^. ) и перекись водорода:

НАДФН ФАД Fe³⁺

 →  → ФАДН/ФМНН →  + O₂ → [Fe²⁺-O₂] → Fe³⁺ + О₂^.

НАДФ⁺ ФАДН₂ Fe²⁺

Такая активность NOS называется NOS-супероксидсинтазной, которую при недостатке аргинина в наибольшей степени проявляет nNOS. Важность этого явления заключается в том, что АФК инициируют другие сигнальные пути, отличные от NO^.-зависимых, а также АФК вместе с NO^. образуют новую высокоактивную частицу – пероксинитрит (ONOOH).

Таблица 5.

Некоторые ткани и клетки, экспрессирующие конститутивную и индуцибельную NO-синтазу

Многие виды клеток могут экспрессировать NOS различных типов. Получены мутантные мыши, лишенные генов каждой из NOS, но все они оказались жизнеспособными. Утрата гена NOSI привела к агрессивности и чрезмерной сексуальности; NOSII-делетированные мыши были более чувствительны к инфекциям; мыши, лишенные гена NOSIII имели повышенное давление крови. Предполагают, что функции утраченной NOS выполнялись оставшимися.

Молекулярные механизмы действия оксида азота (NO^.)

Оксид азота является необычной сигнальной молекулой, так как она свободно секретируется из клетки без участия переносчиков, быстро диффундирует, не связываясь с рецепторами. Внутриклеточные эффекты NO^. зависят от его редокс-состояния. С биологической точки зрения наиболее важными являются редокс-формы - NO^. (2+) и NO⁺ (3+). Свободный радикал NO^. в клетке быстро взаимодействует с молекулярным кислородом и металлами гемсодержащих и негемовых белков. Это приводит к образованию нитрозильных комплексов гемового и негемового железа, которые впервые в 1967 году были обнаружены А.Ф. Ваниным с помощью метода электронного парамагнитного резонанса.

Оксид азота после окисления или взаимодействия с металлами образует NO⁺, который взаимодействует с SH-группами белков. В результате в клетке при достаточном уровне тиолов под влиянием NO^. происходит нитрозилирование и изменение активности металлопротеинов, а также белков, имеющих реактивные цистеины. Регуляция активности белков нитрозилированием является одним из способов контроля функции этих белков в клетке.

Рис. 15. Механизм действия NO^. в клетке

При образовании больших количеств NO^. и О₂^. они могут взаимодействовать с образованием пероксинитрита (ONOOH), который обладает высоким цитотоксическим потенциалом, а также способен вступать в реакцию восстановления с глутатионом и СО₂, образуя нитрозопероксикарбонат (ONO₂CO₂), который вызывает химическую модификацию остатков тирозина в белках.

Кроме того, пероксинитрит является источником цитотоксического ОН-радикала:

О₂^. + NO^. → ONOO^- → ONOOH → OH^. + NO₂^.

В свою очередь АКМ (ОН^., NO^. , ONOO^-) могут окислять белки, липиды, разрушают ДНК.

Таким образом, в основе широкого разнообразия NO-эффектов в клетке лежит изменение редокс-формы NO^., а также дополнительные реакции с металлами, тиолами и остатками тирозина в составе белков. Увеличение количества АФК в клетке может трансформировать эффекты NO^. из защитных в цитотоксические.

Рис. 16. Реакции с участием супероксидного аниона и NO

Молекулярные мишени для оксида азота

Реакции нитрозилирования, которые протекают путем взаимодействия активных форм кислорода с металлами, тиолами, остатками тирозина в белках изменяют их активность. Активность белков при этом может как увеличиваться (гуанилатциклаза, циклооксигеназа, транскрипционный фактор NF-KB, K⁺-каналы), так и уменьшаться (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, протеинкиназа С). Белки-мишени для оксида азота разнообразны. Это мембранные рецепторы, ионные насосы, сократительные белки, ферменты и белки, участвующие в проведении сигнала.

Показано, что активация транскрипционных факторов под влиянием оксида азота увеличивает экспрессию следующих белков:

- белков теплового шока (HSP 70);

- белков антиоксидантной защиты (СОД, ГПО);

- ферритина;

- рецепторов трансферрина;

- ядерного белка р53, опухолевого супрессора;

- семейства белков Bcl-2, регуляторов апоптоза.

Таблица 6

Молекулярные мишени для NO

Одной из основных белковых мишеней для оксида азота является гуанилатциклаза (ГЦ).

Гуанилатциклаза существует в двух формах: растворимой и мембраносвязанной, которые не только являются различными белками, но и отличаются механизмами регуляции. Но только растворимая ГЦ участвует в молекулярных механизмах физиологических эффектов оксида азота.

Растворимая ГЦ широко распространена и обнаружена в цитозоле практически всех клеток млекопитающих. NO^. является эндогенным активатором растворимой ГЦ, что лежит в основе внутриклеточной сигнальной системы: NO^.-растворимая ГЦ – цГМФ.

Растворимая ГЦ – это гем-содержащий фермент, состоящий из двух субъединиц (α и  ). N-концевая часть каждой субъединицы содержит домен, связывающий гем (Fe²⁺). Гем отвечает за чувствительность фермента к оксиду азота. Окисление Fe²⁺ гема в Fe³⁺ снимает чувствительность к NO и может привести к потере гемовой части белка. Растворимая ГЦ – это сульфгидрильный фермент, имеющий на своей поверхности лабильные SH-группы, которые легко окисляются различными эндогенными и экзогенными окислителями и способствует активации фермента. Гем связывается с молекулой фермента через имидазольный лиганд, принадлежащий гистидину-105 -субъединицы.

Каталитический и регуляторный центры фермента разобщены и находятся в разных областях субъединиц. Каталитический участок расположен в С-концевой части α- и -субъединиц, он отвечает только за образование цГМФ и не участвует в активации фермента NO^..

При активации растворимой ГЦ NO^. последний взаимодействует с Fe²⁺ гемма с образованием комплекса нитрозил-гем. При этом атом железа выступает из плоскости порфиринового кольца и структура образовавшегося нитрозил-гемового комплекса приближается по структуре к протопорфирину IX – одному из сильных активаторов фермента (рис.16). В клетке при этом возрастает количество цГМФ, действие которого опосредуется цГМФ-зависимыми протеинкиназами и цГМФ-зависимыми фосфодитэстеразами.

Таблица 7

Механизм действия gGMP

Через эти ферменты цГМФ влияет на работу ионных насосов, скорость фосфорилирования белков. цГМ регулирует функцию сократительных белков, ионных насосов, регуляторных белков, участвующих в проведении сигнала, секреции медиаторов, регуляции транскрипции, трансляции и в регуляции функций митохондрий. Через цГМФ-зависимые фосфодиэстеразы регулируется концентрация цАМФ. Эти изменения проявляются в специфическом функциональном ответе на действие NO:

NO^. как нейрональный мессенджер:

Роль NO^. как биологического мессенджера определяется его физико-химическими свойствами. NO^. является высоколабильным, короткоживущим, реактивным свободным радикалом. Долгое время считалось, что функции мозга обеспечиваются двумя типами передатчиков: возбуждающим и тормозным (ацетилхолин, катехоламины, аминокислоты, нейропептиды).

NO^. является представителем нового семейства сигнальных молекул со свойствами нейротрансмиттера. Отличия NO^. от традиционных нейропередатчиков:

- NO^. не резервируется в синаптических везикулах нервных окончаний;

- высвобождается в синаптическую щель путем свободной диффузии, а не по механизму экзоцитоза;

- NO^. синтезируется в ответ на физиологическую потребность ферментом nNOS из L-аргинина;

- биологические эффекты NO^. в большой степени зависят от малой величины его молекулы, ее высокой реактивности.

Роль NO^. в качестве нейромедиатора и регулятора нервной деятельности во многом связана с функциональным состоянием NМДА (N-метил-Д-аспартат)-рецепторов. Эти рецепторы опосредуют действие возбуждающих аминокислот L-глутамата и L-аспартата как нейромедиаторов, они участвуют в реализации физиологических и патогенных эффектов NO^.. NМДА-рецепторы контролируют катионные Са^2+-каналы в мембарне и локализованы на постсинаптических мембранах. L-глутамат, имеющий исключительно важное значение для деятельности нервной системы, синтезируется в нервных окончаниях из глюкозы и глутаиона, откладывается в синаптических везикулах, откуда высвобождается в синаптическую щель по механизму Са²⁺-зависимого процесса экзоцитоза. Здесь он вступает во взаимодействие с NМДА-рецепторным комплексом постсинаптической мембраны.

В физиологических условиях NМДА-рецепторы находятся в состоянии покоя, их активация глутаматом происходит при его избыточном высвобождении, вызванном усиленной стимуляцией, ведущей к деполяризации мембраны.

Рис. 17. Схематическое изображение активации растворимой

гуанилатциклазы NO^.

В нейронах мозжечка NO^. синтезируется в постсинаптических терминалах, выполняя функцию прямого нейромедиатора.

В гипокампе NO^. синтезируется в постсинаптических нейронах в ответ на активацию NМДА-рецепторов. При этом вход Са²⁺ в клетку через Са²⁺-канал активирует NOS. Образующийся NO^. диффундирует из постсинаптического нейрона в пресинаптический аксон, где модулирует выделение нейромедиатора глутамата. Таким образом, в гипокампе и некоторых других областях мозга NO^. может выступать в роли ретроградного мессенджера. Эти механизма лежат в основе важнейшей физиологической функции NO^. в головном мозгу: NO^. выступает в качестве нейромедиатора как «долговременной депрессии» синапсов в мозжечке, так и феномена «длительной потенции синаптической передачи» в гипокампе, возникающих в ответ на стимуляцию рецепторов (рис.18).

Рис. 18 Механизм нейромедиаторного действия оксида азота

NO^. может принимать участие в патогенезе ряда патологий ЦНС – нейродегенеративных заболеваний, инсультов, болезни Альцгеймера и др. В этих условиях просиходит резкое увеличение высвобождения глутамата, гиперактивация ими NМДА-рецепторов и гибель окружающих участков нейронов. Непосредственной причиной гибели клеток является образующаяся в больших количествах NO^., который приобретает цитотоксическое действие. Это явление получило название глутаматная нейротоксичность.

Таблица 8.