logo
УП Свободные радикалы в живых системах

2.2. Образование супероксидного анион-радикала в митохондриях

У большинства эукариотических организмов аэробный синтез энергии осуществляется в митохондриях. На внутренней мембране митохондрий локализована группа ферментов и белков, образующих митохондриальную дыхательную цепь, по которой происходит транспорт электронов от доноров-кофакторов (НАДН, ФАДН2) к молекулярному кислороду с образованием АТФ. Количество митохондрий в разных клетках варьирует от нескольких органелл до тысяч. Наибольшее их количество в пересчете на грамм ткани млекопитающих выявляется в миокарде, тканях мозга, печени, мышцах. В нормальных условиях при окислительном фосфорилировании в митохондриях менее 5 % кислорода преобразуется в АКМ - О2., который метаболизируется марганцевой изоформой СОД, в результате чего его концентрация поддерживается на низком уровне (10-11М). Однако генерация О2. и других АФК в митохондриях может существенно возрастать при нарушении электрон-транспортной цепи (ЭТЦ), что наблюдается при ишемии реперфузии, избытке Са2+, действии ряда соединений. Установлено, что скорость образования О2. и Н2О2 митохондриями разных видов насекомых, птиц, млекопитающих (мышь, крыса, морская свинка, кролик, свинья, корова) обратно пропорциональны средней продолжительности жизни их представителей.

Митохондрии содержат девять сайтов, способных продуцировать Супероксидный анион-радикал, но наиболее эффективными участками генерации О2. являются комплекс I (НАДН-дегидрогеназа) и комплекс III (убихинол-цитохром с-редуктаза) электрон-транспортной цепи (ЭТЦ). Рассмотрим некоторые из известных сайтов генерации О2. в митохондриях.

1. Редуктаза цитохрома b5 расположена во внешней мембране и экспрессируется во многих тканях млекопитающих. Этот фермент окисляет цитоплазматический НАДН цитохромом b5 внешней мембраны, а также может восстанавливать радикал аскорбата. Митохондриальная редуктаза цитохрома b5 может довольно эффективно генерировать О2., со скоростью 300 нмоль/мин/мг белка.

Активность редуктазы b5 значительно увеличена в тканях больных шизофренией, указывая на ее возможную роль в этиологии этого заболевания.

2. Моноаминооксидазы А и Б (МАО-А, МАО-Б) расположены во внешней мембране митохондрий и катализируют окисление различных биогенных аминов, что сопровождается продукцией О2. и Н2О2. МАО-А и МАО-Б могут быть основным источником перекиси водорода в тканях при ишемии, старении, окислении экзогенных аминов. Предполагают, что значительное возрастание моноаминооксидаз и соответствующее этому увеличение продукции О2. и Н2О2 является существенным фактором повреждения митохондрий при болезни Паркинсона.

3. Дегидрогеназа альфа-глицерофосфата (мтГФДГ) распоположена на внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий. В тканях мышей наибольшая активность мтГФДГ обнаружена в буром жире, скелетных мышцах и тканях мозга. Фермент содержит флавины (ФАД) и катализирует окисление альфа-глицерофосфата до дигидрооксиацетонфосфата, используя убихинон в качестве акцептора электронов. Эта реакция участвует в метабодлизме липидов и челночном механизме окисления цитозольного НАДН в митохондриях, что регенерирует НАД+ для реакций гликолиза. Экспрессия мтГФДГ значительно возрастает при гипертироидизме. Было установлено, что митохондрии мыши и мухи дрозофилы генерируют О2. и Н2О2 при окислении альфа-глицерофосфата.

4. Сукцинатдегидрогеназа (комплекс II, СДГ) – флавин-содержащий белковый комплекс, локализованный во внутренней поверхности внутренней мембраны митохондрий. СДГ окисляет янтарную кислоту (сукцинат) до фумаровой с использованием убихинона в качестве акцептора электронов. Полагают, что СДГ способна генерировать АФК путем окисления ФАДН2 фермента кислородом, что может быть вызвано недостатком убихинона, естественного акцептора электронов для СДГ.

Как уже указывалось, важнейшие источники супероксида в митохондриях находятся в электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) – это комплексы I и III. В митохондриях образование доноров электронов (НАДН, сукцината и др.) дает начало переносу электронов во внутренней мембране от НАДН и сукцината к кислороду, сопряженному с транслокацией протонов. Известно около 20 переносчиков электронов, составляющих ЭТЦ митохондрий; это основные элементы структуры митохондрий, на которые приходится около 25 % белка митохондриальных мембран. Среди переносчиков только НАД, флавины и убихинон являются двухэлектронными, в то время как остальные компоненты ЭТЦ – одноэлектронные. Как правило, в ЭТЦ переносчики электронов расположены в последовательности, при которой их редокс-потенциалы возрастают от -0,32В (НАДФН) до +0,82В (О2). Эта разность окислительно-восстановительных потенциалов, составляющая 1,14В, и есть движущая сила, которая приводит к синтезу АТФ.

Рис. 6. Электрон-транспортная цепь митохондрий

5. Комплекс I (НАДН-убихинон-оксидоредуктаза) является первым звеном окислительного фосфорилирования в митохондриях, у млекопитающих он включает 43 полипептида общей молекулярной массой около 900 кДа. В состав комплекса НАДН-дегидрогеназы входят два флавиновых мононуклеотида, семь железо-серных кластеров и несколько КоQ-связывающих белков. Комплекс I расположен во внутренней мембране митохондрий так, что он доступен как со стороны матрикса, так и из межмембранного пространства. Комплекс I катализирует окисление НАДН матрикса убихиноном внутренней мембраны. Эта реакция обратима и сопряжена с трансмембранным переносом протонов, который генерирует электрохимический потенциал протонов н+. Комплекс I является одним из двух основных порталов, посредством которых восстановительные эквиваленты, полученные в цикле Кребса, поступают в дыхательную цепь (другой портал – СДГ). Предполагается, что АФК-генерирующими центрами в комплексе I могут быть флавин или его комплекс с радикалом НАД, а также железосерные центры комплекса.

6. Комплекс III (убихинон: цитохром с редуктаза) митохондриальной дыхательной цепи катализирует окисление убихинола (QH2) во внутренней мембране митохондрий, используя цитиохром с как акцептор электронов. Окисление QH2 осуществляется в ряде взаимосвязанных реакций, известном как Q-цикл, и сопряженном с векторным переносом протонов и генерацией н+. Комплекс III может генерировать значительные количества супероксида, который затем быстро дисмутирует до Н2О2. В настоящее время общепринято, что источником супероксида в комплексе III является нестабильный радикал семихинона (QH.). Формирование супероксида в комплексе III было прямо показано в 1980 году А.А. Константиновым и его коллегами из лаборатории В.П. Скулачева.

Существование цикла убихинона или коэнзима Q (CoQ) в качестве протон-транспортного механизма было предложено в 1975 году Питером Митчеллом. В основе функционирования такого цикла лежит способность убихинона окисляться и восстанавливаться (CoQН2CoQ) с высвобождением или поглощением двух протонов и электронов. На внутренней мембране митохондрий со стороны матрикса CoQ восстанавливается до CoQН2, мигрирует на другую сторону мембраны и выводит протоны в межмембранное пространство, а электроны поступают в электрон-транспортную цепь на цитохромы с1 и с. Одноэлектронное окисление CoQН2 или восстановление CoQ сопровождается образованием реакционных убисемихинонных радикалов (CoQН.). Окисляясь и восстанавливаясь в ходе транспорта электронов, убихинон может восстанавливать молекулярный кислород с образованием О2.:

CoQН2 + О2 → CoQН. + О2.

CoQН. + О2 → CoQ + Н+ + О2.

При этом в восстановленном состоянии убихинон может ингибировать супероксид, восстанавливая его до Н2О2, также как и другие органические радикалы:

О2. + CoQН2 → Н2О2 + О2 + CoQ + 2 е-

2ROO. + CoQН2 → 2ROOH + CoQ

Таким образом, в митохондриях CoQ является как основным прооксидантом, так и главным антиоксидантом.

Важным источником О2. в митохондриях может служить цитохром b566, входящий в комплекс III. Цитохром b566 в митохондриях может иметь высокий (+245 мв) или низкий (-30 мв) редокс-потенциал в зависимости от того, энергизованы митохондрии или нет, т.е. существует или нет разность электрохимического потенциала протонов между матриксом и межмембранным пространством.

В деэнергизованных митохондриях Ео1 = -30 мв и в этих условиях цитохром b566 обладает высокой восстановительной способностью, в результате чего протекает следующая реакция:

Цитохром b566 (Fe2+) + O2 → цитохром b566 (Fe3+) + О2.

Таким образом, взаимодействие деэнергизованных митохондрий с кислородом приводит к генерации супероксида, что наблюдается при гипоксии (реоксигенации и ишемии/реперфузии).

Установлено, что относительный вклад в продукцию О2. как самих митохондрий, так и компонентов дыхательной цепи значительно отличается для разных органов. Предполагается, что комплекс I является основным продуцентом супероксида в митохондриях мозга, печени и скелетных мышцах, тогда как комплекс III отвечает за образование О2. в митохондриях сердца и легких. Среди фагоцитирующих клеток (перитонеальные и альвеолярные макрофаги, моноциты, гранулоциты) главными источниками супероксида являются митохондрии альвеолярных макрофагов.

Супроксидный анион-радикал, образующийся в ЭТЦ митохондрий, может активировать белки, разобщающие окисление и фосфорилирование. Разобщающие белки (РБ) принадлежат к семейству митохондриальных переносчиков, локализованные на внутренней мембране. Выявлены различные формы РБ, так РБ1 содержится в митохондриях из бурого жира, РБ2 представлен во многих тканях, в скелетных мышцах доминирует РБ3, а в головном мозге – РБ4 и РБ5. Считается, что основное предназначение этих белков – терморегуляция, но они могут выполнять и другие функции. РБ1, локализованный в митохондриях бурого жира и названный термогенин, является классическим митохондриальным разобщающим белком, он активируется при повышении уровня жирных кислот и индукции ПОЛ.

Таким образом, синтез О2. и Н2О2 в ЭТЦ митохондрий может приводить к активации разобщающих белков, снижению н+ и тем самым может способствовать уменьшению продукции АКМ в условиях высокого содержания восстановителей.

Высокая продукция АКМ может вызвать повреждение митохондрий, индуцировать митоптоз, а также служить причиной клеточного апоптоза.

Продукция О2. и апоптоз

Апоптозом выбраковываются клетки, зараженные вирусами, а также клетки, ставшие источниками цитотоксических продуктов одноэлектронного восстановления кислорода, т.е. АФК. Апоптоз, или программированная клеточная гибель, - это процесс клеточной элиминации, обеспечивающий развитие многоклеточного организма в ходе метаморфоза, эмбрио- и морфогенеза, у взрослых особей апоптоз направлен на поддержание гомеостаза за счет удаления клеток, утративших свои функции и клеток, представляющих потенциальную опасность для организма. В 1994 году В.П. Скулачевым было высказано предположение, что аэробная клетка располагает эшелонированной системой защиты от кислорода путем предотвращения образования АФК. Эта система работает в митохондриях наряду с антиоксидантными механизмами и включает три основных этапа действия.

1. «Мягкое» разобщение окисления и фосфорилирования путем повышения протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий. Это явление наблюдается в покое, когда фосфорилирование тормозится из-за недостатка АДФ, что приводит к повышению концентрации кислорода, увеличивает время жизни убисемихинона (CoQH.) и ускоряет генерацию О2. . Далее разобщение ускоряет потребление кислорода, уменьшает время жизни убисемихинона и образование О2. .

2. Полное разобщение дыхания и фосфорилирования вследствие открытия пор во внутренней мембране митохондрий. При этом скорость потребления кислорода дыхательной цепью достигает максимума, что приводит к снижению концентрации кислорода в клетке, а время жизни убисемихинона минимально.

Открытие пор провоцируется ростом концентрации О2. и других АФК. С другой стороны, поры являются механизмом элиминации митохондрий, которые накапливают супероксид.

3. Апоптоз, индуцированный митохондриями. Длительное открытие пор во внутренней мембране митохондрий приводит к набуханию митохондрий, разрыву внешней мембраны, освобождение белка «самоубийства» (Apoptose inducible factor, AIF), запуск апоптоза и элиминация клеток, образующих О2. . Таким образом, порообразование – это сигнал к апоптозу.

Рис. 7. Роль митохондрий в индукции апоптоза

В 1996 году Гвидо Кремер с сотрудниками описали механизм участия митохондрий и роль митохондриальных пор в апоптозе. При разрыве внешней мембраны митохондрий выходит AIF , который локализован в межмембранном пространстве. AIF – это флавопротеин, который переносится из митохондрий в ядро, где участвует в разрезании ДНК на крупные фрагменты и периферической конденсации хроматина. AIF содержит N-концевой ФАД-связывающий и центральный НАДН-связывающий домены, обладает оксидоредуктазной активностью. Считают, что в зависимости от своей локализации в клетке AIF может иметь различные функции:

- в митохондриях он служит ловушкой АФК и способствует выживанию клетки;

- в цитоплазме может вызывать накопление АФК;

- в ядре участвует во фрагментации ДНК.

Наряду с белком «самоубийства» AIF через поры в мембранах митохондрий в цитоплазму может выходить цитохром с, который участвует в образовании апоптосомы и запуске апоптоза.

В настоящее время высказывается предположение, что уровень продукции АФК в митохондриях определяет темп жизни, скорость старения и стратегию эволюционного развития. Так, предполагают, что одной из причин большей продолжительности женщин по сравнению с мужчинами является относительно низкий уровень О2. и Н2О2 и более высокое содержание глутатиона, глутатионпероксидазы и Mn-СОД в митохондриях.