Сравнительные характеристики днк-полимераз e. Сoli

К репликации имеют отношение полимеразы I и III.

Причем именно полимераза III является репликазой, т.е. она синтезирует in vivo новые цепи ДНК.

Участие ДНК-полимеразы I необходимо. У нее вспомогательная, репаративная функция.

ДНК-полимераза II имеет отношение лишь к репарации.

Схема прерывистой антипараллельной репликации Рейджи Оказаки

1968 г.

Исходные посылки: все данные Корнберга, полученные в ферментативной системе in vitro, и "картинки" Кэрнса верны ( но картинки неправильно интерпретированы).

Оказаки специально разработал два новых метода исследования.

1. Метод импульсного мечения. До Оказаки метку давали в культуральную среду и быстро начинали отмывать клетки, но минимальное время подачи метки было 5 мин. Оказаки через нужный момент времени после добавления меченого тимидина давал 1000-кратный избыток холодного (немеченого) тимидина. Таким образом, метка включается только в течение очень короткого времени.

Оказаки считал, что время Кэрнса (5 мин.) очень велико для получения истинной картины происходящего при репликации.

2. Центрифугирование в щелочном градиенте сахарозы. Сахароза разводится на щелочи. В щелочной среде происходит денатурация ДНК. В этом случае короткие фрагменты ДНК, если они есть, отделяются от длинных. После этого их можно выявить при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы, разделяющем молекулы по молекулярному весу.

Оказаки предположил, что синтез ДНК идет короткими фрагментами и что короткие фрагменты должны сшиваться.

Сшиваются они лигазой. ДНК-лигаза была обнаружена как у прокариот, так и у эукариот. У E. сoli были найдены мутанты по лигазе.

Оказаки провел эксперимент на бактериях, зараженных фагом Т4, у которого есть своя термочувствительная лигаза, которая работает при 20 С и не работает при 43 С. Если в клетку попадает фаговая ДНК, то клетка переключается на репликацию ДНК фага.

Клетки заражали фагом Т4, давали импульсную метку Н₃-тимидин и выращивали при двух температурах: 20 С и 43 С. Потом проводили центрифугирование в щелочном градиенте сахарозы.

Лигаза E. coli нуждается в коферменте НАД, а лигаза фага - в АТФ. Если E.coli не давать никотиновую кислоту (предшественник НАД), бактериальная ДНК реплицируется, но не сшивается.

Прерывистость репликации показана для всех объектов, кроме фагов, содержащих одноцепочечную ДНК.

У некоторых фагов и вирусов прерывистый синтез идет по обеим цепям. У бактерий и высших организмов одна цепь образуется непрерывно, а другая - прерывисто (лидирующая и запаздывающая цепи).

Размер фрагментов Оказаки видоспецифичен и составляет для фагов 1000-2000 нукл., E. сoli - 1000 нукл., для эукариот - 200-400 нукл.

Схема размножения фага М13