Глава 14. Вакуолярная система внутриклеточного транспорта

Вакуолярная система, состоящая из одномембранных разнообразных по строению и функциям органелл (эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы, эндосомы, секреторные вакуоли) выполняют общую функцию синтеза, перестройки (модификации), сортировки и выведения (экспорта) из клетки биополимеров, главным образом белков-гликопротеидов, а также функцию синтеза мембран этой системы и плазматической мембраны.

Необходимо отметить, что синтез основной массы клеточных белков протекает на полисомах в цитозоле. Особенностью белкового синтеза в цитозоле является то, что в зависимости от типа иРНК синтезируются различные белки, направляющиеся строго к своим внутриклеточным компонентам. Это связано с тем, что разные по назначению белки имеют определенные “сигнальные” последовательности аминокислот, как бы адреса, по которым разные белки распределяются в клетке. Так ядерные белки имеют NLS-сигнальную последовательность, белки митохондрий имеют свою, так же как белки цитозоля, цитоскелета, пластид и пероксисом - свои сигнальные последовательности. Характерным является то, что все типы перечисленных белков начинают и заканчивают синтез в цитозоле, и затем посттрансляционно с помощью внутриклеточных белковых комплексов переносятся “по адресам”.

В отличие от этих типов белков, белки экспортного назначения и белки мембран синтезируются на рибосомах, расположенных на мембранах эндоплазматического ретикулума и попадают внутрь вакуолей, по мере синтеза полипептидной цепи, котрансляционно. Затем эти белки уже внутри вакуолей, или в составе мембран вакуолей транспортируются внутри клетки.

Общая схема функционирования вакуолярной системы

На рис. 163 представлены мембранные везикулярные компоненты, объединенные в единую функциональную систему. Все они имеют ряд общих свойств: это - одномембранные компартменты, имеющие один общий источник образования (гранулярный эндоплазматический ретикулум). Для всей вакуолярной системы характерна кооперативность ее функционирования, взаимосвязь и последовательность этапов образования, перестройки, транспорта и экспорта синтезированных белков. Вкратце функции отдельных компонентов заключаются в следующем:

1. Гранулярный эндоплазматический ретикулум: котрансляционный синтез растворимых внутривакуолярных белков (секреторные белки, гидролазы лизосом и др.); котрансляционный синтез нерастворимых белков, входящих в состав всех мембран вакуолярной системы; первичная модификация растворимых и нерастворимых (мембранных) белков, их соединение с олигосахаридами - гликозилирование синтезированных белков, образование гликопротеидов; синтез мембранных липидов и их встраивание в мембрану - “сборка мембран”.

2. Отделение вакуолей, содержащих новообразованные продукты и их переход в цис-зону аппарата Гольджи (ЭР-АГ комплекс).

3. Цис-зона аппарата Гольджи: вторичная модификация гликопротеидов; синтез полисахаридов (гемицеллюлоза растений) и гексозаминогликанов.

4. Промежуточная зона аппарата Гольджи: дополнительные модификации гликопротеидов, трансгликозилирование.

5. Транс-Гольджи сеть: сортировка секреторных и лизосомных белков; отделение вакуолей.

6. Экзоцитоз (секреция).

7. Экзоцитоз постоянный.

8. Отделение первичных лизосом с гидролазами.

9. Эндоцитоз.

10. Вторичная лизосома.

11. Рециклизация рецепторов гидролаз.

12. Рециклизация рецепторов плазматической мембраны.

13. Гладкий эндоплазматический ретикулум: синтез и конденсация липидов, депонирование ионов Ca²⁺, синтез и ресорбция гликогена и др.

14. Транспорт в зону аппарата Гольджи.

15. Транспорт от аппарата Гольджи в эндоплазматический ретикулум.

Гранулярный эндоплазматический ретиклум

Отличительной чертой вакуолярной системы является то, что синтезированные полимеры и продукты их превращений отделены от собственно цитоплазмы, от цитозоля, и становятся изолированными от цитозольных ферментов. Такое разобщение очень важно для одновременного протекания в клетке многих синтетических процессов.

Открытие этой внутриклеточной мембранной структуры произошло на заре электронной микроскопии. В 1945 г. К Портер с сотрудниками изучал фибробласты цыплят в электронном микроскопе. В это время еще не была разработана техника ультратонких срезов, поэтому авторы просматривали клетки на просвет, целиком. В световом микроскопе в фибрибластах после фиксации и окраски видно, что периферия клеток (эктоплазма) окрашивается слабо, в то время как центральная часть клеток (эндоплазма) хорошо воспринимает красители. Портер увидел в электронном микроскопе, что зона эндоплазмы заполнена большим числом мелких вакуолей и каналов, соединяющихся друг с другом и образующих что-то наподобие рыхлой сети (ретикулум). Было видно, что стопки этих вакуолей и канальцев ограничены тонкими мембранами. Так был обнаружен эндоплазматический ретикулум, или эндоплазматическая сеть. Позднее, в 50-х гг., при использовании метода ультратонких срезов удалось выяснить структуру этого образования и обнаружить его неоднородность. Самым же главным оказалось, что эндоплазматический ретикулум (ЭР) встречается практически у всех эукариот.

Подобный электронно-микроскопический анализ позволил выделить два типа ЭР: гранулярный (шероховатый) и гладкий.

На ультратонких срезах гранулярный ЭР представлен замкнутыми мембранами, которые образуют на сечениях вытянутые мешки, цистерны или же имеют вид узких каналов (рис. 164, 165). Ширина полостей цистерн может очень варьировать в зависимости от функциональной активности клетки. Наименьшая ширина их может составлять около 20 нм, в расширенном виде они достигают диаметра в несколько мкм. Отличительной чертой этих мембран является то, что они со стороны гиалоплазмы покрыты мелкими (около 20 нм) темными, почти округлыми частицами, гранулами.

Впервые эти гранулы были описаны Дж. Паладе (гранулы Паладе), который доказал, что они представляют собой рибонуклеопротеиды. Теперь хорошо известно, что эти гранулы являются ни чем иным, как рибосомами, связанными с мембранами ЭР. На мембранах рибосомы расположены в виде полисом (множество рибосом, объединенных одной информационной РНК), имеющих вид плоских спиралей, розеток или гроздей. Это работающие, синтезирующие белок рибосомы, которые прикрепляются к мембранам своей большой субъединицей.

Гранулярный (или шероховатый, в отличие от гладкого) ЭР может в клетках быть представлен или в виде редких разрозненных мембран или же в виде локальных скоплений таких мембран (эргастоплазма) (рис. 166). Первый тип гранулярного ЭР характерен для недифференцированных клеток или клеток с низкой метаболической активностью. Эргастоплазма характерна для клеток, активно синтезирующих секреторные белки. Так, в клетках печени гранулярный ЭР собран в отдельные зоны (тельца Берга), так же как в некоторых нервных клетках (тигроид). В клетках поджелудочной железы гранулярный ЭР (эргастоплазма) в виде плотно упакованных друг около друга мембранных цистерн занимает базальную и околоядерную зоны клетки.

Наличие полисом на мембранах однозначно показывает на то, что гранулярный ЭР является важным местом синтеза белков.

Количество рибосом на ЭР четко связано с его синтетической активностью. Так, на мембранах ЭР в клетке несекретирующей молочной железы связывается до 25% клеточных рибосом, после стимуляции лактации их количество там возрастает до 70%. Падение числа рибосом на мембранах ЭР может происходить при дифференцировке клеток. Например, при частичном удалении печени у грызунов резко стимулируется деление клеток в оставшейся части. Это сопровождается редукцией гранулярного ЭР и обеднение его рибосомами: число свободных рибосом, не связанных с мембранами, достигает 40%. Такое же уменьшение числа рибосом, связанных с ЭР, наблюдается при различных патологических состояниях клеток ( при алкагольном хроническом отравлении происходит уменьшение числа связанных рибосом на 25%).

Рибосомы, связанные с мембранами ЭР, участвуют в синтезе белков, выводимых из данной клетки, “экспортируемых” белков.

Действительно, большое число клеток многоклеточных организмов, богатых гранулярным ЭР, синтезирует и выводит огромное количество белков. Так, например, клетки ацинусов поджелудочной железы синтезируют и выделяют массу белков - ферментов, участвующих в расщеплении пищи в кишечном тракте (протеиназы, липазы, нуклеазы и др.); клетки печени - альбумины крови; плазмоциты - -глобулины; молочной железы - казеин; слюнной железы - пищеварительные ферменты, амилазу и РНКазу и т.д. Такая же картина наблюдается у растений: железистые клетки, выделяющие белковые вещества, богаты гранулярным ЭР. Другими словами, у многоклеточных организмов клетки, богатые эргастоплазмой, синтезируют выводимые из этих клеток белки, необходимые или для работы других клеток, или для выполнения общеорганизменных функций (пищеварительные ферменты, белки плазмы крови, гормоны и др.).

У одноклеточных также можно наблюдать гранулярный ЭР, который, по-видимому, участвует в синтезе выводимых экспортируемых белков. Среди таких белков могут быть не только ферменты внеклеточного пищеварения.

Следовательно, роль гранулярного ЭР заключается не просто в участии в синтезе белков на рибосомах его мембран, но и в процессе сегрегации, обособления этих синтезированных белков, в их изоляции от основных функционирующих белков клетки. Эта функциональная особенность гранулярного ЭР очень важна, так как она связана с целым рядом процессов, приводящих к выделению таких белков с помощью вакуолей аппарата Гольджи.

Котрансляционный синтез растворимых белков

Пути синтеза белков на рибосомах ЭР можно представить в следующем виде (рис. 167). Еще в гиалоплазме происходит связывание иРНК, кодирующей секреторный белок, с рибосомой и начинается синтез белковой цепи. Важным является то, что сначала синтезируется “сигнальная последовательность” , богатая гидрофобными аминокислотами. В нее входит 16-30 аминокислот. Эта “сигнальная последовательность” в цитозоле узнается и связывается с “узнающей сигнал частицей” (SRP-частица), состоящей из одной молекулы 7S РНК и 6 различных полипептидных цепей. SRP-частица связывается после узнавания сигнального конца синтезирующейся молекулы белка с рибосомой, что приводит к полной остановке синтеза белка. На поверхности же мембраны ЭР, обращенной к гиалоплазме расположены интегральные рецепторные белки, связывающиеся с SRP-частицами. В результате SRP-частица связывается со своим рецептором и одновременно связывает данную рибосому с мембраной ЭР.

Такая “заякоренная” рибосома с SRP-частицей, блокирующей дальнейший рост полипептидной цепи, взаимодействует с большим белковым комплексом, транслаконом. После связывания рибосомы с транслаконом происходит отделение SRP-частицы и синтезированный первичный пептид входит в канал диметром около 2 нм, который образует транслакон. После этого возобновляется синтез полипептида, он удлиняется и его сигнальная последовательность, вместе с растущей цепочкой оказывается внутри полости цистерны ЭР. Таким образом синтезируемый белок проходит сквозь мембрану ЭР во время его синтеза, т.е. котрансляционно, одновременно с его трансляцией. Внутри полости ЭР с помощью фермента (сигнальная петидаза) сигнальная последовательность отщепляется. После окончания синтеза вся белковая молекула оказывается в полости ЭР и в это время рибосома отделяется от транслакона и диссоциирует. После этого в транслаконе канал закрывается. Во время трансмембранного переноса растущей белковой цепи происходит ее связь с олигосахаридами (гликозилирование - см. ниже). В полости цистерн ЭР белки претерпевают ряд дополнительных изменений: образуются дисульфидные связи, происходит их правильное сворачивание, происходит сборка четвертичной структуры белков. Только белки с правильной конформацией в дальнейшем будут переноситься в зону аппарата Гольджи.

Синтез нерастворимых (мембранных) белков

В гранулярном ЭР происходит синтез белков, которые, встраиваясь в мембрану ЭР, становятся интегральными мембранными белками (рис. 168).

Начальные стадии синтеза мембранных белков похожи на таковые при синтезе растворимых белков. Здесь также участвуют SRP-частицы, узнающие сигнальную последовательность, также происходит прохождение начального участка белковой цепи через транслакон. Однако в цепи синтезирующегося мембранного белка существует одна или несколько аминокислотных стоп-последовательностей, которые препятствуют белковой цепи пересекать мембрану и белок в области стоп-сигнала остается связанным с мембраной, но при этом синтез белка на рибосоме не останавливается. Это приводит к тому, что в области стоп-сигнала локализуется гидрофобный -спиральный участок, а весь белок остается встроенным в мембрану. В некоторых белках число -спиральных “заякоревающих” участков может быть от одного до нескольких. Так, например, белок транспорта глюкозы (GLUT-1) имеет 12 таких участков. Мембранные белки, также как и растворимые могут подвергаться различным модификациям. Наиболее характерной из них для ЭР является первичное гликозилирование - ковалентное связывание белковой цепи со сложным олигосахаридом. В результате этого синтезирующийся белок становится гликопротеидом.

Большинство белков, синтезированных в гранулярном ЭР, относится к гликопротеидам. Связывание синтезирующейся белковой цепи с олигосахаридами происходит также котрансляционно. При этом на белковую молекулу переносится готовый блок олигосахаридов, который связывается с аспарагиновыми остатками белковой молекулы (рис. 169). Этот олигосахаридный комплекс содержит 2 молекулы N-ацетилгликозамина, 9 молекул маннозы и 3 молекулы глюкозы и связан со специальным липидом долихолом на внутренней поверхности мембраны ЭР, смотрящей в просвет вакуоли ЭР. По мере транслокации белковой цепи во время ее синтеза, каждый аспарагиновый остаток связывается с олигосахаридным комплексом, с помощью фермента, являющегося интегральным белком мембран ЭР. Первичной модификации, гликозилированию, подвергаются как растворимые, так и мембранные белки, синтезирующиеся в ЭР.

Синтез клеточных мембран

Итак, на рибосомах ЭР происходит синтез основной части мембранных белков клетки. Синтез этих белков отличается от синтеза секреторных тем, что по мере синтеза мембранные белки не освобождаются от мембран, а остаются в их составе, становясь таким образом или трансмембранными интегральными белками, или полуинтегральными.

В ЭР происходит синтез и сборка липидов самих мембран, включая фосфолипиды и холестерол. Ферменты, участвующие в синтезе липидов, встроены в мембрану ЭР со стороны цитозоля, и синтез липидов происходит на мембране там же. Таким образом синтезированные липиды встраиваются в мембрану ЭР в липидный слой со стороны цитоплазмы, но переносятся на внутреннюю сторону с помощью переносчиков фосфолипидов. Таким образом билипидный слой мембраны растет, увеличивая поверхность вакуоли или цистерны ЭР. Этот процесс идет одновременно с синтезом интегральных мембранных белков, так что липопротеидная мембрана, как таковая, строится и растет за счет двух процессов: синтеза и встраивания липидов, и синтеза и интеграции мембранных белков. Необходимо подчеркнуть, что такое “зарождение” мембран вакуолярной системы происходит только в гранулярном ЭР.

Сегодня можно сказать, что важнейшей функцией гранулярного ЭР, вне зависимости от специализации или тканевой принадлежности клеток, является функция образования, построения клеточных мембран, которая заключается в том, что элементы гранулярного ЭР синтезируют все мембранные белки, синтезируют липидный компонент мембран, но, кроме того, именно в гранулярном ЭР происходит сборка липопротеидных мембран.

Этот процесс хорошо прослежен и проанализирован на примере образования вируса везикулярного стоматита (VSV) (рис. 170). Это РНК-содержащий вирус, построенный из небольшого числа белков и покрытый снаружи липопротеидной мембраной. В зрелой частице VSV кроме одной молекулы РНК есть белок, входящий в рибонуклеопротеидный комплекс (N-белок), белок, крепящий этот комплекс с окружающей мембраной (М-белок), и специфический белок мембранной оболочки (G-белок). Мембранная оболочка VSV произошла от клетки хозяина, в которой этот вирус развивается: по мере выхода РНП вируса происходит образование выроста плазматической мембраны, напоминающего короткую микроворсинку, куда включается нуклеоид (РНП) вируса, затем такой вырост отделяется от поверхности клетки, и получается готовая зрелая частица VSV. Благодаря G-белку такая частица может специфически контактировать с незараженной клеткой; мембрана VSV и плазматические мембраны клеток сливаются, а вирусный рибонуклеопротеид оказывается в цитоплазме клетки, где развивается инфекционный процесс. При этом останавливаются синтезы нормальных белков клетки-хозяина, и начинается синтез только вирусных белков на рибосомах инфицированной клетки. Вирусная РНК кодирует только пять белковых молекул. Две из них являются ферментами, необходимыми для репликации и транскрипции вирусного генома, третья - N-белок, четвертая кодирует M-белок, пятая - специфический гликопротеин, G-белок. Это интегральный белок мембраны, окружающий зрелую вирусную частицу. G-белок состоит из 550 аминокислот и имеет две боковые полисахаридные цепи. Он асимметрично расположен в мембране, большая его часть вместе с углеводными цепочками торчит наружу, а 30 аминокислот локализованы с цитоплазматической стороны мембраны.

При заражении клеток VSV с молекулы его РНК считывается пять разных иРНК, с помощью которых на рибосомах клетки происходит синтез вирусных белков. N-белок и M-белок синтезируются на свободных полисомах и связываются с размножившимися молекулами вирусной РНК и с мембраной клетки. Синтез G-белка происходит на полисомах гранулярного эндоплазматического ретикулума. В этом случае синтез G-белка также начинается с синтеза “сигнальной” аминокислотной последовательности, которая проходит сквозь мембрану и как бы тянет за собой остальную растущую цепь аминокислот. Однако, в отличие от секреторных белков G-белок остается связанным с мембраной ЭР. Большая его часть находится в просвете цистерн ЭР, где она принимает специфическую конформацию и присоединяет два первичных участка углеводных цепей. Часть молекулы G-белка погружена и проходит через билипидный слой мембраны, а небольшой участок С-конца торчит на цитоплазматической части мембраны. Дальнейшая судьба G-белка хорошо прослежена: через 20-30 мин после синтеза он обнаруживается в составе интегральных белков аппарата Гольджи. Здесь происходит дополнительный рост его углеводных цепей. Позже его обнаруживают в составе интегральных белков плазматической мембраны.

Из этих экспериментов следует, что интегральные белки мембран эндоплазматического ретикулума, мембран аппарата Гольджи, секреторных вакуолей и плазматической мембраны имеют одно происхождение: они синтезируются и встраиваются в мембрану в гранулярном ЭР.

Следовательно, гранулярный эндоплазматический ретикулум представляет собой настоящую “фабрику” клеточных мембран. От того, какие интегральные и периферические белки будут синтезироваться на рибосомах ЭР, и от того, какие фосфолипиды будут здесь синтезироваться и включаться в мембрану, будет зависеть тип образующегося нового участка мембраны; будет ли он компонентом гладкого ЭР, мембран аппарата Гольджи, лизосомы, или плазматической мембраны.

Транспорт между ЭР и аппаратом Гольджи

Дистальные участки гранулярного ЭР, которые расположены в зоне, приближенной к аппарату Гольджи (АГ), теряют рибосомы и образуют мембранные выступы, от которых отпочковываются мелкие вакуоли, содержащие синтезированные в ЭР белки. Эта зона называется ЭР-АГ-промежуточный компартмент (ERGIC) или везикулярно-тубулярная группа (VTC) (рис. 171). Вакуоли, отщепившиеся в этой зоне от ЭР, транзитные элементы, покрыты окаймляющим белковым слоем, аналогичным клатриновому слою эндоцитозных вакуолей. Белки этого слоя также относятся к COP-белкам, в данном случае отщепляющиеся вакуоли покрыты комплексом COP II, состоящим из нескольких гетеродимеров, связанных с мембраной посредством белка Sar 1p, малой ГТФазой (рис. 172). Отделившиеся от ЭР вакуоли становятся окаймленными пузырьками, затем они теряют белковую оболочку и сливаются друг с другом и транспортируются с помощью микротрубочек к цис-зоне аппарата Гольджи, где и сливаются с его мембранами. Адресность и точность слияния любых вакуолей с другими мембранами определяется специальными белками SNARE (рецептор белков, участвующих в прикреплении и слиянии мембран).

После деполимеризации окаймляющего слоя COP II на поверхности вакуоли открываются интегральные мембранные белки - V-SNARE. Эти белки специфичны для каждого типа вакуолей, направляя их к тому участку, где они должны слиться с другими мембранами. Там они связываются с мембранными белками T-SNARE и SNAP25 (рис. 173). В местах взаимодействия этих двух групп белков и происходит слияние мембран.

Таким образом происходит транспорт синтезированных белков в зону аппарата Гольджи.