2.3 Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток

Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (ЕS). ЕS-клетки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипотентности. Например, в определенный сайт несущественного гена в их геноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно отобрать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных животных. Это позволяет избежать случайного встраивания, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных системКузнецов А.В., Кузнецова И.В. // Онтогенез, 2005, Т.26, № 4, с. 300-309. .

Рекомбинантные гены вводят в такие клетки любым из вышеупомянутых способов, а кроме того, электропорацией или другими стандартными методами, применяемыми для доставки генов в культивируемые соматические клетки. При этом вместе с исследуемыми генами возможно введение селектируемых маркеров, которые позволяют проводить отбор клеток, экспрессирующих данные маркеры и, следовательно, гарантированно содержащих сцепленные с ними исследуемые гены. Отобранные таким образом клетки переносят в бластоцисты развивающихся эмбрионов или используют для получения агрегационных химер объединением их с клетками восьмиклеточных эмбрионов с последующей пересадкой эмбрионов псевдобеременным самкам.

При трансфекиии ЕS-клеток в культуре вектором, предназначенным для интеграции в специфический хромосомный сайт, в некоторых клетках ДНК встраивается случайным образом, в других встраивание происходит в нужный сайт, в большинстве же ЕS-клеток интеграции вообще не происходит. Для увеличения числа клеток первого типа используют так называемую позитивно-негативную селекцию. Эта стратегия состоит в позитивной селекции клеток, несущих векторную ДНК, встроившуюся в нужный сайт, и негативной селекции клеток с векторной ДНК, интегрировавшей в случайный сайт Кузнецова И.В., Кузнецов А.В., Сигаева В.А. и др. // Биотехнология, 2003, с. 2-5..

Сайт-мишень должен находиться в такой области геномной ДНК, которая не кодирует важных белков, чтобы интеграция чужеродной ДНК не повлияла на процессы развития или клеточные функции. Кроме того, существенно, чтобы встраивание трансгена не блокировало трансляцию соответствующего участка генома. Поиск подобных сайтов ведется непрерывно.