1.4 Факторы, влияющие на процесс микроклонального размножения

На эффективность микроклонального размножения влияет масса факторов различной природы. Это физиологические особенности вводимого в культуру растения, химические и физические условия культивирования. Наиболее важным моментом является выбор материнского растения и экспланта.

При выборе материнского растения необходимо учитывать его физиологические, сортовые и видовые особенности. Исходные растения должны быть здоровы, не поражены грибными, бактериальными и вирусными болезнями. Кроме того, они должны находится в состоянии интенсивного роста (выход из фазы покоя и переход к активному росту). Луковицы, корневища и клубни в состоянии покоя непригодны, перед введением в культуру их предварительно обрабатывают высокими или низкими температурами. Способность к размножению также детерминирована генетически. Например, земляника размножается всеми способами, облепиха - ни одним, хотя в природе черенкуется. Двудольные обладают большей регенерационной способностью, чем однодольные и древесные (Факторы… 2011).

При выборе экспланта необходимо учитывать его возраст, строение и происхождение. Для обеспечения максимальной стабильности клонируемого материала, во избежание появления аномальных растений в качестве экспланта желательно использовать молодые, слабодифференцированные ткани. Кроме того, экспланты от ювенильных растений лучше укореняются, чем от зрелых, особенно это касается древесных пород. Лучше всего использовать кончики стеблей, пазушные почки, зародыши, молодые листья, черенки, соцветия, чешую луковиц, то есть экспланты, содержащие меристемы. Опыты с эмбрионами кукурузы, проведенные Грином и Филипсом в 1975 году, показали, что при извлечении эмбрионов из зрелых семян они образуют каллус и корни. Если же изолировать их через 2 - 3 недели после опыления, то образуются и каллус, и растения. Вероятно, это связано с разворачиванием генетической программы в онтогенезе растения. Следует отметить, что не всегда молодые ткани являются удачным объектом для размножения. У эхеверии на эксплантах из молодых листьев возникают только корни, из старых - только побеги, из средних по возрасту - и побеги, и корни. Чем меньше размер экспланта, тем меньше его регенерационная способность. С другой стороны, в крупном экспланте увеличивается возможность появления в его клетках вирусов и других патогенов, что препятствует оздоровлению тканей.

Длительность культивирования также влияет на эффективность микроразмножения. Физиологическое состояние экспланта меняется в течение пассажей, при длительном культивировании частота укореняемости побегов возрастает. Возможно, что при этом эксплант приобретает признаки ювенильности, что ведет к повышению его морфогенетического потенциала.

Стерилизация. Успех введения в культуру часто определяется эффективностью стерилизации. Выбор стерилизующего агента определяется особенностями экспланта. Для нежных тканей концентрация стерилизующего агента должна бать снижена, чтобы сохранить жизнеспособность экспланта. Часто внутреннее заражение исходных эксплантов бывает намного сильнее, чем поверхностное, поэтому экспланты предварительно обрабатывают фунгицидами и антибиотиками против грибной и бактериальной инфекций. Хорошие результаты дает обработка растений бензоатом натрия.

При культивировании in vitro соблюдают определенные правила асептики в ламинар-боксе. В этом случае асептика достигается подачей профильтрованного стерильного воздуха, направленного из ламинар-бокса наружу, на работающего.

Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или фольгу, стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160 градусов в течение 1,5-2 часа.

Инструменты перед работой стерилизуют спиртом.

Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120 градусов и повышенном давлении в течение 15-20 минут.

Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация, которую проводят следующим образом. Предварительно часть растения, которая необходима для работы, промывают водой с мылом и ополаскивают проточной водой. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ (спирт, хлорамин). После выдерживания в дезинфицирующих растворах части растения несколько раз несколько раз промывают в дистиллированной воде.

Питательные среды. В зависимости от вида растений необходимо испытывать как твердые, так и жидкие питательные среды. Иногда жидкие среды имеют преимущество, так как обеспечивают большую подвижность трофических элементов. Например, при размножении роз более успешным было культивирование побегов на двухслойной питательной среде: нижний слой - агаризованный, верхний - жидкий. На эффективность размножения могут также влиять расположение экспланта (горизонтальное или вертикальное), тип пробок (ватные, пластмассовые, стеклянные, металлические и так далее), а также соотношение объема эксплантов и количества питательной среды для оптимального освещения и газообмена эксплантов.

Состав питательной среды необходимо подбирать для каждого вида растений. На клональное микроразмножение влияют гормоны, минеральные соли, витамины и углеводы. При микроразмножении in vitro часто используют среды Мурасиге и Скуга, Линсмайера и Скуга, Шенка и Хильдебрандта, Нича, Гамборга, Хеллера и другие. Обычно используют среду Мурасиге-Скуга, которая содержит много неорганического азота, что стимулирует процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза. Вообще вопрос оптимального соотношения NH4 : NO3 остается открытым, так как универсального рецепта для всех видов растений нет. В качестве источника углеродного питания используют различные углеводы типа сахарозы, глюкозы, фруктозы, галактозы. Разные культуры требуют различной концентрации углеводов на разных этапах клонального микроразмножения.

При приготовлении твердых питательных сред для поверхностного выращивания каллусных тканей используют очищенный агар-агар - полисахарид, получаемый из морских водорослей.

Среда Мурасиге и Скуга - самая универсальная. Она пригодна для образования каллусов, поддержания неорганизованного каллусного роста, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Так, изменение соотношения ауксина и кинетина приводит к образованию либо корней (преобладание ауксина), либо стеблевых культур (преобладание кинетина).

Среда Гамборга и Эвелега хорошо подходит для культивирования клеток и тканей бобовых растений и злаков; среда Уайта обеспечивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации; среда Нича и Нич пригодна для индукции андрогенеза в культуре пыльников (Питательные… 2011)

Образование и рост каллусной ткани контролируется фитогормонами типа ауксинов и цитокининов. Под действием ауксинов происходит дедифференцировка, а под влиянием цитокининов - интенсивное деление, в результате которого образуется ткань.

Спонтанное образование каллусной ткани в природе мы можем наблюдать на месте повреждения. Каллусные клетки затягивают рану, а впоследствии дифференцируются в утраченные ткани растения. Например, когда вы черенкуете розы или другие древесные растения, то на месте нижнего среза, погруженного в воду вырастает мозолеобразое образование - каллус, из которого затем формируются корни, происходит укоренение черенка. Очень часто каллус формируется на поврежденных корнеплодах моркови (особенно в месте среза листьев), на черешках кочанов капусты.

Каллусную ткань также можно получить на искусственных питательных средах, включающих фитогормоны, используя фрагменты самых разных частей растения: стеблей, корней, тканей клубня, листьев, зародышей, семядолей и т.д. Такие фрагменты называются эксплантами (Микроклональное… 2011).

К физическим факторам выращивания относятся температура и условия освещения. Большинство каллусных тканей могут расти в условиях слабого освещения или в темноте, так как не способны фотосинтезировать. Вместе с тем свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и активирующий процессы вторичного синтеза. Высокая интенсивность света может вызывать хлорозы и задерживать развитие, но при переносе в почву эти растения чувствуют себя лучше и растут энергичнее. Спектральный состав также играет немаловажную роль. Некоторые исследователи указывают на синий свет как основной компонент морфогенеза. Красный свет стимулирует образование почек у табака, у салата - образование побегов, у березы - укоренение. В работах Т.Н. Константиновой с соавторами (1987) показано, что синий свет усиливает закладку вегетативных почек у побегов табака в условиях in vitro , а красный стимулирует развитие цветочных почек. Однако при добавлении цитокининов и ауксинов в различной концентрации соотношение процессов дифференциации цветочных и вегетативных почек меняется, в некоторых случаях наблюдается даже противоположный эффект. В исследованиях Р. А. Карначук и Е. С. Гвоздевой (1998) наибольший выход морфогенных каллусов пшеницы, формирующих растения и побеги, отмечен на зеленом свету. Важное значение играет также сочетание спектрального состава света и гормональных факторов среды (Константинова, 1988).

Температура культивирования обычно варьирует в интервале 22 - 26оС днем и 18 - 22оС ночью. В некоторых случаях понижение температуры ведет к повышению эффективности размножения. Для повышения коэффициента размножения необходимо каждому виду с учетом его естественного ареала произрастания подбирать индивидуальные условия культивирования. Относительная влажность воздуха - 65 - 70% (Бекер, 1990).

Таким образом, микроклональное размножение зависит от многих факторов внешней среды, и действие их не всегда хорошо известно. Поэтому при введении в культуру нового вида растений необходимо прежде всего тщательно изучить влияние физических факторов на рост и физиологические характеристики этой культуры.