Геном человека

реферат

6. Методы отбора гибридных клонов

После введения гибридных ДНК в клетки их выращивают на питательной среде, но не все выращенные клетки содержат нужные гибридные ДНК. Поэтому были выработаны методы, позволяющие среди многообразия клеток выделить клоны, содержащие целевые гибридные ДНК. Эти методы в генетической инженерии называются методами скрининга (отбора).

Самый простой метод - это когда ген кодирует белок, который сама клетка не производит, но без этого белка не может расти. Микроорганизмы, возникающие при мутации, которым необходимы определённые факторы для роста, но исходным микроорганизмам они не требовались, называются ауксотрофами. Например, в клетки-ауксотрофы по аминокислоте гистидину ввести вектор с геном, кодирующем белок, который участвует в биосинтезе гистидина. И если выращивать эту культуру на питательной среде без гистидина, то выжившие клетки будут содержать гибридную ДНК.

Также в вектор могут вводить такой маркер, как ген фермента люциферин-люцифераза. Данный фермент имеется у светлячков, благодаря которому они и светятся. Колонию бактерий тоже можно отобрать по этому признаку (если у неё имеется ген люциферин-люциферазы и присутствует АТФ, как источник энергии).

Отбор клонов упрощается, если в векторе будут присутствовать гены устойчивости к антибиотикам и антиметаболитам. Возможно даже введение генов устойчивости к нескольким антибиотикам, тогда отбор клонов будет наиболее точный и качественный. Например, если плазмида кодирует устойчивость одновременно к тетрациклину и ампициллину, и в результате встройки в неё чужеродного фрагмента нарушается ген устойчивости к ампициллину, но устойчивость к тетрациклину сохранилась. Затем плазмиду вводят в клетку, культуру высевают на питательной среде с добавлением тетрациклина. Клетки, содержащие векторную плазмиду, будут стабильно расти. Далее колонии перепечатывают на чашки с ампициллном и чашки с тетрациклином. Те колонии, которые после перепечатки будут расти на среде с тетрациклином и не дают роста на среде с ампициллином, содержат гибридные плазмиды.

Ещё один очень эффективный способ отбора колоний основан на иммунологических тестах. Обычно его применяют тогда, когда клонируют ген уже достаточно хорошо известного белка, на который можно выработать антитела. Впервые этот метод был применён для отбора клонов кишечной палочки, содержащих ген инсулина. После того как в бактерии введён вектор, их выращивают на питательной среде, а затем снимают с культуры бактерий репликон (отпечаток) на пластинки из поливинилхлорида, к которым пришиты антитела на инсулин. Следовательно, в тех местах, где были клетки секретирующие инсулин, к антителам прилипнет данный фермент. Обнаружить эти места можно с помощью других антител, меченных радиоактивным йодом 125I. А радиоактивную метку обнаруживают на рентгеновской плёнке посредством авторадиографии. По положению радиоактивных зон на полимерной пластинке можно установить местоположение колоний бактерий с активным геном инсулина.

Именно такими методами осуществляется отбор колоний с необходимыми функциями и данные методы постоянно совершенствуются.

Делись добром ;)