1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Мобильные элементы D. melanogaster как индукторы гибридного дисгенеза

МГЭ D. melanogaster по разным оценкам занимают от 15 до 22% всего генома. Это относительно небольшая часть по сравнению с высшими растениями, эндосимбиотическими бактериями и даже человеком. Каминкер в своей работе 2002 года, проанализировав геномную последовательность дрозофилы, установил наличие в ней 85 известных и 8 новых семейств МГЭ, которые встречались в количестве от 1 до 146 копий на геном. Идентифицировано 1572 полноразмерных и неполноразмерных МГЭ, что составляет 3,86% всей проанализированной последовательности эухроматина. Более чем две трети найденных элементов оказались неполноразмерными. В центромерных районах хромосом плотность МГЭ в 4,7 раз больше, чем в других районах. МГЭ дрозофилы предпочитают встраиваться в межгенные пространства, и часто располагаются в пределах другого МГЭ того же или иного класса и эти оценки не окончательны [40].

Сегодня МГЭ (их активация) считаются одним из основных факторов эволюционного процесса. Известно, что активное перемещение МГЭ индуцируется тепловым шоком. Система ответа на тепловой шок активируется не только повышением температуры, но и воздействием других весьма разнообразных внешних факторов: вирусным заражением клеток, обработкой ядами, детергентами, другими химическими факторами, нарушением энергетического обмена клеток и т.д. Все эти воздействия являются стрессовыми, неблагоприятными, а реакция системы теплового шока - генерализованной [39]. Кроме того, уровень транскрипции и транспозиций некоторых МГЭ индуцируются гамма-облучением, а также в определенных скрещиваниях, вызывая сложный набор изменений, который принято называть гибридным дисгенезом (редукция гонад, повышение частоты мутаций и модификаций, наличие рекомбинации у самцов) [31].

МГЭ подразделяют на три класса: ретротранспозоны, транспозоны и MITEs (III). Ретротранспозоны с помощью обратной транскриптазы (ревертазы) осуществляют синтез нити ДНК на РНК-матрице. Такие МГЭ составляют примерно 2% генома дрозофилы. Ретротранспозоны по своей структуре неоднородны. Ретротранспозоны 1-го класса характеризуются рядом следующих свойств:

1. Дисперсная локализация в геноме.

2. Специфическая копийность от 4-8 копий на геном (например, gypsy) до 200 копий у Dm225.

3. Харакртерный для каждого МГЭ размер (от 5 до 85 kb).

4. Встраивание в хромосомы хозяина в форме провируса.

5. Наличие в структуре длинных концевых повторов (LTR).

6. Наличие двух открытых рамок считывания (ORF): gag-, которые имеют гомологию с геном gag ретровируса, кодирующего 3 белковых компонента нуклеотидной сердцевины вириона, и pol-, напоминающий вирусный ген pol, кодирующий белки, необходимые для транспозиции (протеаза, Pr, обратная транскриптаза, RT, РНК-аза Н, интеграза, Int). У некоторых МГЭ имеется 3-я рамка считывания, env, сходная с геном env, кодирующим гликопротеиновую оболочку вируса.

Ретротранспозоны класса 2 не имеют концевых повторов, содержат 2 открытые рамки считывания: первая, gag-подобный мотив, и вторая, эндонуклеазный домен, кодирует обратную транскриптазу и РНКазу H. Следствием дисперсной локализации МГЭ в геноме и их способности к траспозициям является высокий уровень их полиморфизма как по количеству общих сайтов (мест) внедрения в хромосомы, так и по числу стабильных мест посадки, характерных для каждой популяции и линии [23].

В отличие от ретротранспозонов, передвижение которых имеет в своём алгоритме синтез РНК из ДНК с последующим обратным ДНК из молекулы РНК, то есть метод «копировать и вставить», транспозоны передвигаются по геному способом «вырезать и вставить». Это осуществляется благодаря комплексу ферментов транспозазы. Информация об аминокислотной последовательности белка транспозазы закодирована в последовательности транспозона. Кроме того, этот участок ДНК может содержать другие, связанные с транспозоном последовательности, например гены или их части. Большинство ДНК-транспозонов имеют неполную последовательность. Такие транспозоны не являются автономными и передвигаются по геному благодаря транспозазе, которая закодирована другим, полным, ДНК-транспозоном. Транспозаза способна делать двухцепочные разрезы ДНК, вырезать и вставлять в ДНК-мишень транспозон [34].

Естественно, что после открытия нового класса генетических объектов, в частности, у дрозофилы, возник вопрос об их роли в геноме. Первоначально МГЭ считались «геномными паразитами», которые способны к самостоятельным автономным перемещениям в геноме, наследоваться вместе с другими генами генома и быть причиной инерционного мутагенеза [3]. До некоторого времени представление о МГЭ как об «эгоистической ДНК» оставалось доминирующим. Однако постепенно накапливались факты, свидетельствующие о том, что МГЭ выполняют в геноме определенные функции [19]. Так, МГЭ содержат разнообразные функциональные сайты - знаки пунктуации и управления (промоторы, терминаторы, операторы, репликаторы, энхансеры, регуляторные сайты теплового шока [25], которые существенны для окружающих участков генома. Инсерции МГЭ в кодирующие зоны генов приводят к нарушению или резкому изменению их функций. Это связано с прямым нарушением генов и с влиянием знаков пунктуации (промоторов, терминаторов и др.) на процессы считывания. Доля таких мутаций особенно велика у прокариот, которые имеют высокую плотность кодирования информации в геноме [29]. Инсерции МГЭ в некодирующие области (спейсеры, интроны, фланговые участки др.) приводят к более "мягким" последствиям: усилению или ослаблению активности близлежащих генов, изменению их регуляции и т.п. Такие последствия преобладают у высших эукариот, у которых кодирующая часть генома составляет ~3-5%. Показано также, что среди видимых мутаций у дрозофилы и других объектов наиболее значительную долю составляют не замены нуклеотидов, а именно инсерции МГЭ [23].

В ряде своих работ Б. Мак-Клинток в 1984 г. продемонстрировала индукцию транспозиций ретротранспозонов у дрозофилы при помощи стрессовых температурных воздействий. В ранних работах Мак-Клинток было обнаружено, что условием вспышки транспозиций являются присутствие и определенное аллельное состояние второго регуляторного элемента [21]. Энгельс в 1989 г. показал, что транспозиции P-элемента дрозофилы индуцируются при определенном (дисгенном) скрещивании линий дрозофил, имеющих разный цитотип, но только в варианте + M-цитотип Ч > Р-цитотип. В ряде работ было показано, что индуцирующими факторами транспозиций МГЭ могут быть такие генетические процессы, как инбридинг, аутбридинг и изогенизация. Кроме того, в многочисленных селекционных экспериментах был продемонстрирован сопряженный ответ на отбор количественных признаков и рисунков локализации мобильных элементов [34].

Рассмотрим подробнее механизм индукции синдрома гибридного дисгенеза такими МГЭ, как Р- и hobo- транспозоны дрозофилы.

Р-элемент. Одним из первых исследованных и наиболее изученных у дрозофилы является мобильный Р элемент. Его размеры могут варьировать от 0,5 до 2,9 т.п.н. Различные линии мух обычно несут 50-60 копий этого элемента, и треть этих копий является полноразмерными. Для перемещения элемента in vivo необходимо наличие определённой последовательности длиной 150 п.н. на каждом конце транспозона. Встраивание этого элемента приводит к возникновению дупликации в 8 п.н. в участке ДНК, где он встраивается. Полноразмерный элемент имеет 4 открытых рамки считывания, или 4 экзона. В зародышевых клетках транскрипт включает все эти последовательности и продукт, считываемый с этой матрицы, является транспозазой, белком, который обеспечивает перемещение транспозона. В соматических клетках в белковом продукте последовательность 3-го интрона не представлена и этот белок является репрессором I типа. Тогда как белки, синтез которых обеспечивается неполноразмерными копиями Р элемента, называются репрессорами II типа [35].

Линии, не содержащие Р элемент называют линиями с М цитотипом. Линии, содержащие Р элемент, но не характеризующиеся в системе дисгенных скрещиваний достаточно высоким уровнем редукции гонад называют линиями с Q цитотипом. Линии же с наличием Р элемента и характеризующиеся уровнем редукции гонад от 10 до 100 % называют линиями с Р цитотипом. Выделяют также линии М цитотипа, которые имеют некоторое количество копий Р элемента, но в дисгенных скрещиваниях ведущие себя как М линии [22].

Линии D. melanogaster, собранные в природе до 1950 года (Америка) и до 1960 года в других популяциях мира и далее содержащиеся в лабораториях, как правило, не содержат Р элемента и, соответственно, характеризуются М цитотипом. Считается, что D. melanogaster была инфицирована этим МГЭ в средине прошлого столетия и этот элемент происходит из генома Drosophila willinstoni, обитавшей на Карибах и в Юго-восточной части Северной Америки. В последующие десятилетия этот мобильный элемент очень быстро распространился в популяциях D. melanogaster всего мира. Считается, что сегодня в мире не существует природных популяций D. melanogaster, геном которых был бы свободен от этого мобильного элемента [3].

hobo-элемент. Транспозон hobo - ещё один мобильный элемент, способный вызывать синдром гибридного дисгенеза у дрозофилы и успешно колонизирующий представителей этого вида. Он принадлежит к суперсемейству мобильных элементов hAT [28]. Полноразмерная копия этого элемента состоит из около 3 т.п.н., включая инвертированные терминальные повторы в 12 п.н. Встраивание элемента hobo в сайт мишень приводит к образованию дупликаций в 8 п.н. Полноразмерный элемент имеет 2 открытых рамки считывания, одна из которых кодирует транспозазу, состоящую из 658 аминокислотных остатков, статус второй, расположенной выше и состоящей из 32 кодонов, до сих пор не ясен. hobo транспозаза отвечает не только за перемещение элементов, которыми кодируется, но и за активацию МГЭ других классов, например Hermes. Канонический hobo элемент содержит три ТРЕ повтора (треонин (Т), пролин (Р), глутаминовая кислота (Е)), состоящих из 9 п.н. каждый и кодирующих вышеуказанную последовательность аминокислот. Полагают, что предковый элемент имел 10 таких повторов. Большинство природных популяций D. melanogaster являются мономорфными и содержат hobo элемент с тремя ТРЕ. Однако существуют и полиморфные популяции, содержащие различное количество ТРЕ, они обнаруживаются только в Северной Европе, Южной Африке и Экваториальной Африке [26].

В геноме дрозофилы элемент hobo представлен тремя различными формами: (1) полно- и неполноразмерными элементами; (2) элементами с внутренними делециями и (3) последовательностями, подобными элементу hobo - hRS (hobo-related sequences), которые считаются остатками реликтовых hobo элементов (тех, которые инвазировали группу предшественника группы melanogaster на раннем этапе). Считается, что перемещаться могут все эти последовательности, используя канонический hobo как источник транспозазы. Показано, что некоторые цис-регуляторные элементы hobo способны распознаваться транскрипционными факторами генов развития дрозофилы, что свидетельствует о возможности использования этих последовательностей в качестве материала в процессе эволюции [20].

Считается, что существует 2 класса линий в отношении hobo элемента. Это Н линии, которые содержат 3 т.п.н. полноразмерные элементы и многочисленные их производные меньшего размера. И второй класс - это Е линии, характеризуются отсутствием полноразмерных элементов, однако, имеют некоторое количество их фрагментов. Н линии обычно содержат от 2 до 10 полноразмерных копий hobo на геном, а дефектных элементов 30-75. Гибридный дисгенез наблюдается в реципрокных скрещиваниях Н и Е линий и характеризуется повышенной частотой возникновения мутаций, включая хромосомные перестройки, и редукцию гонад [31]. Структура, распространение в геноме и генетическое поведение этого МГЭ в общих чертах подобны системе Р элемента [28].

Таким образом, мобильные генетические элементы являются индукторами мутагенеза и модификаторами генной активности, а, следовательно, могут приводить к изменению фенотипического проявления (экспрессивности) различных признаков путём регуляции экспрессии кодирующих их генов [3].

1.2 Явление и значение атрофии гонад, как признака гибридного дисгенеза

Активация мобильных элементов в системах гибридного дисгенеза вызывает, среди прочих нарушений, особый вид стерильности гибридов, которая обусловлена недоразвитием гонад [19]. Дисгенная стерильность по-разному проявляется в трех системах гибридного дисгенеза. P-M дисгенез [35] приводит к недоразвитию яичников у гибридных самок и семенников у самцов, в I-R системе [37], не происходит изменения морфологии гонад, но увеличивается количество дефектных яиц и частота гибели эмбрионов (SF-стерильность). Активация hobo элементов в H-E системе гибридного дисгенеза приводит как к недоразвитию гонад у самок и самцов первого поколения, так и к высокому уровню доминантных леталей среди отложенных яиц [28].

Стерильность является следствием потери зародышевых клеток на стадиях раннего эмбриогенеза и личинки. Для P-M гибридного дисгенеза гибель зародышевых клеток значительно усиливается при повышении температуры до 29 С [22]. Атрофия гонад один из характерных и интенсивно изучаемых аспектов P-M и H-E систем гибридного дисгенеза. GD-стерильность является следствием вымирания клеток в примордиальной зародышевой линии возможно из-за хромосомных разрывов, опосредованных активностью P-элемента [21]. Однако ни кинетика гибели зародышевых клеток, ни число клеток, которые должны быть элиминированы для появления GD-стерильности не известно. Первые признаки стерильности появляются уже у 5-6 часовых эмбрионов. Максимальный уровень гибели клеток наблюдается на личиночной стадии развития, когда зародышевые клетки испытывают экспоненциальный рост, но некоторые умирающие клетки были обнаружены до деления клеток зародышевой линии [36].

Механизм гибели клеток может быть обусловлен разрывами хромосом, имеющими летальный эффект. Следствием этого является отсутствие половых клеток в яичниках и семенниках и общее недоразвитие их у взрослых гибридных самок и самцов. Гибриды могут быть полностью стерильны, если редуцированы обе железы и частично фертильны, если атрофирован один семенник или яичник [30]. Неатрофированные гонады у дисгенных гибридов часто отстают в своем развитии и содержат меньшее число яиц или сперматоцитов по сравнению с недисгенными особями [36].

Степень выраженности гонадной атрофии сильно зависит от температуры, при которой идет развитие гибридов. В отношении Р-М системы атрофия наиболее значительна при 29 С у самок и при 27 С у самцов, а при 24 С и ниже практически отсутствует [24]. Для Н-Е системы характерна наиболее сильная атрофия при 25С и наименьшая при 29 С [27]. При более низких температурах АГ наблюдается в меньшей степени. Количество и размерность копий Р- и hobo-элементов так же сильно влияют на способность индуцировать гибридный дисгенез, в связи с чем, частота гонадной атрофии может изменяться от нескольких до ста процентов [32].

Сказать точно, в чем заключается адаптивное и /или эволюционное значение синдрома гибридного дисгенеза пока сложно. Предполагается, что атрофия гонад (одно из проявлений синдрома гибридного дисгенеза) является одним из механизмов реализации нескрещиваемости видов и особей из разных популяций и, следовательно, может быть компонентом механизмов видообразования. Примером являются популяции дрозофилы, которые скрещиваясь на границе ареалов дают стерильное потомство. Это объясняется тем, что МГЭ, локализированные в геноме особей данной популяции, обладающей, скажем, Р- или Н-цитотипом, при скрещивании с особями другой популяции (с противоположным цитотипом) дают стерильное потомство[34].

В то же время существует и другая, противоположная эволюционная функция МГЭ, которая несёт адаптивное значение для организма. Известно, что при попадании организма в стрессовые условия, начинается активная транспозиция МГЭ в геноме. В результате перемещений и встраивания в геномные последовательности, изменяется активность генов, синтезируемые ими продукты, что влечет за собой каскад реакций, которые непосредственно влияют на дальнейшее функционирование клеток, органов и организма в целом. Эти изменения могут быть разнонаправлены, повышать или снижать адаптивные возможности индивида, но при этом основной их задачей является увеличение разнообразия особей в популяции. Наиболее приспособленные к сложившимся стрессовым условиям особи будут иметь шанс выжить и размножиться [29].

1.3 Соматические проявления гибридного дисгенеза и механизмы их формирования

МГЭ имеют определенную структурную организацию, благодаря которой могут перемещаться в геноме как в пределах одной хромосомы, так и между хромосомами различных клеток и тканей. Как уже было сказано, МГЭ имеют способность увеличивать число копий в геноме хозяина, вызывать мутации в соматических и генеративных тканях, встраиваясь в гены или окрестности генов, служить причиной хромосомных перестроек, влиять на фертильность особей и даже приводить организм к гибели [31]. Возникающие мутации могут не сказываться на жизнеспособности организма, если они возникли в гене, который отвечает, например, за формирование фенотипического признака [19].

Транспозиции МГЭ, способных вызывать синдром гибридного дисгенеза, как было показано в работах некоторых авторов, приводят не только к атрофии гонад, но и к различным мутациям в соматических тканях. В редких случаях мутационные изменения могут иметь адаптивное значение и особи с такими мутациями получают преимущество перед другими сородичами для выживания и оставления потомства. Однако, чаще всего, мутации вредны для организма и приводят к стерильности или гибели особи. Перемещения МГЭ при гибридном дисгенезе у дрозофилы происходят преимущественно в клетках зародышевого пути. Причина различной активности МГЭ в клетках соматических и генеративных тканей подробно изучена у Р-элемента и заключается в особенностях тканеспецифичного сплайсинга транспозазной пре-м-РНК. Однако в ряде работ были описаны случаи перемещения ретротранспозонов в соматических клетках у высших организмов [38].

Что касается транспозонов, существуют единичные данные, прямо или косвенно свидетельствующие о соматической активности этих элементов. Так, например, Коваленко Л.В. в своей работе на тему hobo-элемент как фактор нестабильности генома D. melanogaster в клетках генеративных и соматических тканей получила такие результаты: hobo-элемент способен проявлять транспозиционную активность в клетках соматических тканей. Во-первых, выявлена взаимосвязь между присутствием в геноме активного hobo-элемента и повышением частоты рекомбинаций на клетках крыла Drosophila melanogaster. Во-вторых, с помощью метода FISH, продемонстрировано перемещение hobo-элемента в клетках соматических тканей у Drosophila melanogaster и получена оценка частоты hobo-транспозиций - 3,5x10-2 на сайт, на Х-хромосому [29].

Активность мобильных элементов в P-M и H-E системах гибридного дисгенеза обусловливает мутабильность некоторых нестабильных локусов. В P-M системе наибольшую известность получил локус singed-weak [35], в H-E системе локус vgal [26] и сконструированный маркерный элемент h(w+). Аллель snw обусловлена инсерцией двух дефектных P-элементов и делеция одного или другого из этих элементов в присутствии транспозазы полноразмерных элементов приводит к появлению соответствующих производных аллелей sne и sn(+). Повышенная мутабильность локуса vgal обусловлена активацией дефектных копий hobo в присутствии активных элементов этого семейства. Генетически сконструированный маркерный элемент h(w+) представляет hobo-элемент со встроенным геном mini-white, который определяет оранжевую окраску глаз [23]. Маркерная white линия несет в X-хромосоме два сконструированных элемента h(w+). Это обусловливает оранжевый фенотип цвета глаз, но при эксцизии одного из элементов цвет становится менее выраженным [31]. Линии с нестабильными аллелями широко используются при оценке активности P и hobo-элементов в дисгенных скрещиваниях, и частота мутирования этих аллелей служит дополнительным количественным критерием.

Таким образом, контроль активности мобильных генетических элементов в системах гибридного дисгенеза тесно взаимосвязан с механизмами транспозиций и репарации генетических повреждений. Это обусловливает чувствительность гибридного дисгенеза к действию внешних факторов и его модификацию различным генетическим фоном. Существующие предпосылки позволяют рассматривать синдром гибридного дисгенеза не только как показатель активности некоторых семейств мобильных генетических элементов, но и как целостную генетическую систему, обеспечивающую контроль генетической изменчивости генотипа в неблагоприятных условиях [29].

В целом же, вопрос об активности транспозонов в соматических клетках D. melanogaster остается открытым. Выявление возможности и изучение особенностей транспозиций МГЭ в соматических клетках имеет большое значение, поскольку в ряде работ описан повреждающий эффект соматических перемещений Р-элемента . Более того, соматические мутации представляют собой потенциальную угрозу малигнизации клеток [2].

1.4 Связь экспрессивности признака cubitus interruptus Dominant с экспрессией гена ciD

In(4)ciD - инверсия, при которой промоторные участки и первые экзоны генов pan и ci меняются местами (Рис 1.). ciD - гибридный ген, в котором промотор pan направляет экспрессию белка CI с N-концевым участком белка PAN. Предполагаемый белковый продукт состоит из первых 246 аминокислот белка PAN, которые сливаются с рамкой считывания CI, в которой отсутствуют первые 13 аминокислот N-конца. Небольшая, цитологически невидимая инверсия [43].

Рис. 1. Структура аллеля ciD

Видимая мутация. Доминантный аллель рецессивной мутации с летальным эффектом в гомозиготе. У гетерозигот ci[D] прервана жилка крыла L4, возможно появление эктопических жилок, крылья слегка расставлены, постериорный край крыла слит с алулой, характеризуется увеличенными щетинками и зачастую рваный (Рис.2.). Гетерозиготы характеризуются утратой щетинок, расположенных по краю крыла. Этот фенотип усиливается при мутации panS28 [44]. В середине первого ряда тарзальных щетинок часто отмечаются пробелы, тогда как терминальные щетинки присутствуют всегда Может проявляться в виде неполных продольных и поперечных жилок, а также в виде изменений морфогенеза ног и глаз. Дефекты жилкования наследуются как доминантные, дефекты сегментации - как рецессивные.

В жилковании крыла отмечаются пробелы: L4 может прерываться в двух местах - проксимальнее и дистальнее передней поперечной жилки; в L5 отмечается дистальный пробел. L3 и L5 утолщены. Может наблюдаться сплетение и узлование жилок. Крылья широкие, деформированные или выгнуты кверху, часто расставлены и загнуты назад. Гемолимфа из аксиллярных дыхалец черная при высушивании. Внутренний край крыла немного «гребешковидный», волоски формируют пучки. H/+ подавляет «гребешковидный» фенотип ciD, но увеличивает пробел в L4 [45].

Сила и направление температурных эффектов зависит от генетического фона.

ciD относится к координирующим генам: их функция - разделить сегменты, установить позиционные градиенты вдоль передне-задней оси крыла. Другие гены определяют дорзо-вентральную и проксимально-дистальную идентичности. Предполагается, что это один из генов, разделяющих зачаток диска на серию отдельных секторов, границы которых определяют местоположение формирования жилки. Мутации в таких генах перенаправляют или удаляют жилки, или изменяют симметрию крыла [43].

Мутация сильно влияет на жизнеспособность. Гомозиготы летальны в эмбриональном периоде [45]. У эмбрионов нарушается сегментация. Передние части сегментов дуплицируются зеркально. Задние части отсутствуют. Каждый сегмент практически полностью покрыт зубцами.

Рис. 2. Фенотип ciD и нормальный не мутантный фенотип

Нормальные волоски элиминируются с задних дозальных сегментов и замещаются чистой кутикулой и розеточными зубцами. ЦНС эмбрионов относительно нормальна [44]. Фенотип потомства не зависит от кого из родителей был получен аллель ciD. Гетерозиготы ciD/l(4)102ABc прогибают в эмбриональном периоде, ciD/l(4)102ABb погибают в эмбриональном или личиночном периоде, компаунды ciD/ciCe-2 могут доживать до стадии куколки. Особи нежизнеспособны в комбинации с Ax/Ax или Ax/Y.

Для гена ciD установлено взаимодействие з другими генами. Данные обобщены на рисунке 3.

Рис. 3. Взаимодействие ciD с другими генами: тёмно-синий - взаимодействие первого порядка; голубой - взаимодействие второго порядка; зелёные стрелки - усиление; красные стрелки - супрессия; чёрные стрелки - наложение усиления и супрессии.

ciD эпистатичен к hh11, smo1 и fu513. Индуцированные ревертанты по аллелю и фенотипу ciD характеризуются наличием молекулярных отклонений в структуре ciD транскрипта и демонстрируют включение транскрипта в фенотип ci, т.е. наличие пробелов в жилковании. Синонимичные обозначения: ciD; CiD; ciD; ci-D [45].

Таким образом, ciD - морфологическая мутация с варьирующей экспрессивностью и плейотропным эффектом на жизнеспособность особей.

2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Модельный объект - D. Melanogaster

Дрозофилы являются типичными представителями отряда двукрылых насекомых. Двукрылые (отр. Diptera) - самый многочисленный отряд среди насекомых (класс Insecta). Важнейшие признаки отряда - наличие одной пары крыльев (вторая пара крыльев представлена жужжальцами) и полное превращение. Этот отряд делится на два подотряда: 1) длинноусые (Nematocera) - двукрылые насекомые с длинными многочленниковыми усиками, у сам-цов нередко перистыми и 2) короткоусые (Brachicera) - двукрылые насекомые, обладающие укороченными усиками. С точки зрения систематики, все дрозофилы относятся к подотряду Короткоусые двукрылые, семейству Плодовые мушки (Drosophilidae), которое включает более 2500 видов. Латинское название семейства произошло от названия рода Drosophila («любящий влагу, росу»), впервые описанного Фалленом в 1823 г [1].

Наиболее известным и распространенным видом является Дрозофила чернобрюхая Drosophila melanogaster. Она 2 мм в длину. От других видов отличается тем, что у самцов мушки вершина брюшка черная. Мушка дрозофила, как и все двукрылые, имеет три стадии развития: яйцо, личинка, куколка, имаго [35].

По-видимому, первым, кто начал разводить дрозофил в лабораторных условиях, был энтомолог Вудворт, а генетик Касл впервые сообщил о значении дрозофил для генетических экспериментов. Однако в полной мере дрозофила стала использоваться для генетических экспериментов в лаборатории Томаса Ханта Моргана. Затем с ней работали Герман Меллер, Николай Владимирович Тимофеев-Ресовский и многие другие известные ученые, целый ряд которых стал лауреатами Нобелевской премиих [36].

Благодаря своим особенностям дрозофила является удобным объектом генетических исследований: дрозофила используется, как модельный организм для различных исследований уже почти сто лет, и сегодня многие учёные продолжают работать над различными проблемами дрозофилы. Её важность для здоровья человека была признана Нобелевской премией, вручённой медикам-физиологам Ed Lewis, Christiane Nusslein-Volhard and Eric Wieschaus в 1995 г [33].

Есть несколько причин, тому, что дрозофила - один из излюбленных объектов изучения.

Быстрая смена поколений. Многие виды проходят развитие от яйца до половозрелой особи менее чем за две недели.

Легкость разведения. Даже новичок в состоянии скрещивать и разводить плодовых мушек с неизменным успехом.

Дешевизна. Разведение мух в больших количествах обходится дешево; они питаются забродившими фруктами и дрожжами.

Малые размеры. Для разведения мух не требуется больших помещений, часто достаточно нескольких банок.

Многочисленность потомства. Оплодотворенная самка дрозофилы может произвести на свет сотни потомков.

Соотношение полов. Большинство видов дрозофилы производит примерно равное число потомков того и другого пола; исключения из этого правила обычно составляют интерес для генетиков.

Партеногенез. У некоторых видов существуют расы, состоящие почти исключительно из самок.

Небольшое число хромосом в кариотипе. Хромосомное число у дрозофил невелико; в кариотипе некоторых видов содержится всего лишь 3 пары хромосом.

Хромосомы слюнных желез личинок. Благодаря большим размерам этих гигантских, испещренных поперечными полосами хромосом, исследователь может распознать даже малые участки отдельных хромосом.

Гибриды. Существование целого ряда близкородственных видов позволяет проводить их гибридизацию в лабораторных условиях.

Мутанты. Мутантов можно легко получать в лабораторных условиях, воздействуя на мух такими мутагенами, как рентгеновские лучи или различные химические соединения.

Изолирующие механизмы. У дрозофилы имеется несколько различных изолирующих механизмов (в частности, репродуктивная изоляция и стерильность гибридов), препятствующих межвидовому обмену генетическим материалом.

Цитоплазматическая наследственность. В некоторых случаях имеющиеся у дрозофилы внехромосомные носители наследственности передаются от родителей к потомству.

Дрозофила изначально использовалась для генетических исследований, например, для изучения закономерностей различных типов наследственности. В настоящее время D. melanogaster -- один из наиболее изученных видов живых организмов. Её геном полностью секвенирован. D. melanogaster используется для исследования взаимодействия генов, генетики развития, оценки негативных эффектов медицинских препаратов [36].

Сейчас муха используется также как объект изучения других разделов биологии (особенно, биологии развития: здесь изучается развитие целого организма из относительно простого оплодотворённого яйца), и как учебный объект [1].

Короткий период развития от яйца до имаго, исключительное богатство мутационных рас с характерно чётким фенотипическим проявлением, малое число хромосом и ряд других важных преимуществ делают её незаменимой для практической проработки основных закономерностей наследственности [35].

2.2 Материал исследования

В исследовании использовались 3 лабораторные линии D. melanogaster из коллекции кафедры генетики и цитологии Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина: сiD C-S (мутация сubitus interruptus Dominant (сiD) на генетическом фоне Canton-S (C-S)), W-10, Пирятин.

сiD C-S - линия, в которой мутация сubitus interruptus Dominant была предварительно переведена на генетический фон линии дикого типа Canton-S путём последовательных насыщающих скрещиваний с отбором на маркерный фенотип.

сubitus interruptus Dominant (ciD): лабораторная линия. Линия характеризуется наличием гибридного гена ciD, образованного в результате инверсии. Данный ген способен вызывать видимую мутацию с летальным эффектом в гомозиготе. У гетерозигот мутация проявляется в виде прерванной жилки крыла L4, возможно появление эктопических жилок, слияние постериорного края крыла с алулой, часто наблюдается рваный край крыла. Кроме того, может отмечаться дистальный пробел в L5 [44].

Canton-Special (C-S): лабораторная линия, полученная из природной популяции долины Кантон, штат Огайо, США. Отселектирована Бриджесом. Несёт рецессивную мутацию множественных торакальных и скутеллярных щетинок, которая частично перекрывает дикий тип, но проявляется спорадически в линиях, частично полученных из Canton-S. Хромосомы клеток слюнных желез нормальны. Поддерживается в коллекции с 1960-х годов [46].

w-10: лаборатрная линия дикого типа Harwich (содержит полноразмерный Р-элемент; Р-цитотип)

Пирятин: линия полученная от родителей, отловленных в природе в окресностях г. Пирятин. Предполагается наличие hobo-элемента [47]

2.3. Методы исследования

2.3.1 Схема эксперимента

Мух скрещивали по 3 пары и содержали при температуре 23-24оС на стандартной сахарно-дрожжевой среде.

2.3.2 Тест на атрофию гонад

Уровень стерильности проводили по тесту атрофии гонад особей первого поколения, полученных в скрещиваниях самок линии ciDC-S D.melanogaster с самцами из линий, содержащих Р- или hobo-элемент (Рис.4.), а также анализировали особей контрольных линий Пирятин и W-10. Скрещивали по 3 пары (in masse). Перед анализом морфологии яичников и семенников полученных гибридных особей содержат для созревания 2-3 дня при температуре 25оС. Подсчитывали особей с односторонней (А1) и двусторонней атрофией (А0). Частоту атрофии гонад (АГ) вычисляли как %АГ=%А0 + 1/2% А1[30].

Мух вскрывали под бинокуляром препаровальными иглами в воде.

Рис. 4. Атрофия гонад у самок (верхняя строка) и самцов (нижняя строка) дрозофилы: a -- нормальные гонады; b -- односторонняя атрофия гонад; с -- двусторонняя атрофия гонад

2.3.3. Методика оценки экспрессивности признака сiD

Экспрессивность количественного признака сiD оценивали по соотношению длины отсутствующего участка жилки к проекции её полной длины [43]. Измерение осуществляли на фотографиях имаго, выполненных с помощью стереоскопического микроскопа и цифровой камеры. Обработка фотографий производилась с помощью программного обеспечения ImageJ, а вычисления - Homacosoft XQR2. Результат выражался в долях.

2.3.4 Методы статистического анализа

Частоту атрофии гонад (АГ) вычисляли как %АГ=%А0 + 1/2% А1 (Marin et al., 2000). Для всех вариантов эксперимента рассчитывали ошибку выборочной доли (Атраментова).

Сравнение выборочных долей проводили при помощи критерия Фишера.

Показатель экпрессивности усредняли в каждом варианте опыта. И для каждого среднего рассчитывали статистическую ошибку.

Сравнение экспрессивности в разных вариантах эксперимента проводили при помощи дисперсионного анализа количественных признаков [18].

Для вычислений использовали программное обеспечение Microsoft Excel и STATISTICA_8.0.550.

3. ОХРАНА ТРУДА И БЕЗОПАСНОСТЬ В ЧРЕЗВЫЧАЙНЫХ СИТУАЦИЯХ

Охрана труда - это система правовых, социально-экономических, организационно-технических, санитарно-гигиенических и лечебно-профилактических мероприятий и средств, направленных на сохранение жизни, здоровья и трудоспособности человека в процессе трудовой деятельности [5]. Государственная политика в области охраны труда направлена на создание безопасных и здоровых условий труда, предотвращение несчастных случаев и профессиональных заболеваний.

Первостепенным ее принципом является приоритет жизни и здоровья работающих. Реализация принципов и задач охраны труда связана с научным прогнозированием возможных чрезвычайных ситуаций в производственном процессе и выполнение мероприятий, привлечение средств снижающих их уровень риска.

При выполнении научно-исследовательских работ в области генетики в роли потенциального источника опасности могут выступать исследуемые биологические объекты, методы работы с ними, а также результаты исследования. Перед началом выполнения работы со мной был проведен первичный инструктаж [6] по технике безопасности при работе в биологической (генетической) лаборатории. Суть данного инструктажа касалась изложения правил безопасного выполнения работ.

При выполнении данной курсовой работы биологическим объектом, на котором проводилось исследование, являлись различные линии (в том числе и сконструированные в лаборатории, но не генетически модифицированные согласно определению вида Drosophila melanogaster [9]. Данный вид не является напрямую опасным для человека, а также не является переносчиком возбудителей заболеваний человека. Он представляет собой всемирно признанный модельный генетический объект и не значится ни в одном из списков видов, представляющих реальную или потенциальную биологическую угрозу, в законодательной базе Украины [13, 14, 15]. Тем не менее, разведение данного объекта в лабораторных условиях связано с использованием химических реактивов, электроприборов и лабораторной посуды. При выполнении курсовой работы использование упомянутых оборудования и материалов осуществлялось в соответствии с типовыми и местными инструкциями по технике безопасности, разработанным службой охраны труда ХНУ имени В.Н. Каразина и утвержденными в надлежащем порядке [Инструкции по охране труда № 71, № 5; Инструкция о мероприятиях пожарной безопасности в служебных и конторских помещениях (офисах)], а также в соответствии с инструкциями, прилагающимися непосредственно к приборам и расходным материалам.

Так, при работе с данным биологическим объектом (для его наркотизации) используется диэтиловий эфир - химическое соединение, которое входит в список №2 (Прекурсоры, относительно которых устанавливаются контрольные мероприятия) Списка наркотических средств, психотропных веществ и прекурсоров [7]. Все виды работ, требующие использования данного соединения выполнялись под вытяжкой [8].

Поскольку источником электрической безопасности является электрический ток, основными источниками потенциальной опасности в ляаборатории могут стать - электроприборы (термостат, сухо-жаровой шкаф, электроплита, осветители к микроскопам), розетки, выключатели, ПК, поэтому разработаны соответствующие меры защиты согласно нормативным требованиям ГОСТ 14254-69, ГОСТ 14255-69, ПУЭ-87. В лаборатории для обеспечения работы электрооборудования применяется переменный ток, напряжением 220 В. По степени опасности поражения электрическим током данное помещение приравнивается к помещениям без повышенной опасности, согласно ПУЭ-87 [10].

Основными мерами защиты от поражения электрическим током являются:

обеспечение недоступности токопроводящих частей, которые находятся под напряжением, для случайного прикосновенья;

контроль и профилактика повреждений изоляции;

организация безопасной эксплуатации электроустановок.

Понятие пожарная безопасность означает состояние объекта, при котором исключается возможность пожара, а в случае ее возникновения предотвращается влияние на людей опасных факторов пожара и обеспечивается защита материальных ценностей.

В лаборатории используется электрооборудование, которое отвечает классу пожарной зоны помещения категории Д, степень огнестойкости III, степень защиты светильников не ниже ІР-2Х; категория защиты домов от молнии установлена ІІІ.

Согласно ГОСТ 12.1.004-91 [11] пожарная безопасность обеспечивается системой предотвращения пожара и пожарной защиты и проведением организационных мер. Помещение лаборатории оснащено углекислотным огнетушителем ВВК-1,4 и ведром с песком. Организационными мероприятиями по обеспечению пожарной безопасности является обучение работников кафедры правилам пожарной безопасности, разработка и реализация норм и правил пожарной безопасности, инструкций о порядке работы с пожароопасными материалами. Как профилактические меры по предупреждению причин пожаров используется постоянный контроль за состоянием электрической проводки и соединительных проводов. Обязательно наличие плана эвакуации. Ширина, высота и пропускная способность проходов и выходов отвечает противопожарным нормам.

Закон Украины об « Охране окружающей среды» был принят 25 июня 1991 года (редакции Закона происходили в 1993 г., 1996 г.) [12]. Закон определяет правовые, экономические, социальные основы охраны окружающей среды. Задача Закона состоит в регулировании отношений в области охраны природы, использовании и воспроизведении природных ресурсов, обеспечении и ликвидации последствий негативного влияния на окружающую среду хозяйственной и другой деятельности человека, сохранение природных ресурсов, генетического фонда наций, ландшафтов и других естественных объектов. Международные стандарты включают требования сниженного энергопотребления и ограничения допустимых уровней мощности, потребляемых в неактивном режиме. Необходимо выполнять требования стандарта ISO - 14004 [16], что определяет требования к организации производственного процесса с минимальным убытком, для окружающего природного среды.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

1. Анализ атрофии гонад

Анализ межполовых различий уровня атрофии гонад в линиях и у гибридов показал следующее (Рис.4). Линия Пирятин характеризуется высоким показателем АГ у самок, тогда как этот показатель у самцов данной линии - в пределах нормы, что по данным литературы составляет около 5 % [27]. В скрещивании ciDC-S x Пирятин уровень АГ у самцов не превышает допустимого значения для данного вида, тогда как самки отличаются незначительным увеличением этого показателя. Линия ciDC-S характеризуется достаточно высоким показателем АГ, как у самцов, так и самок. У потомков от скрещивания ciDC-S x W-10 выявлено, что уровень АГ самцов находится в пределах нормы, тогда как самки характеризуются сравнительно высокими значениями данного показателя. В линии W-10 более высокий уровень АГ установлен для самок и менее высокий - для самцов.

Рис. 4. Межполовые различия уровня атрофии гонад в линиях и у гибридов

При сравнении потомков от разных скрещиваний можно отметить, что самки в скрещивании ciDC-S x Пирятин характеризуются сниженным уровнем АГ по сравнению с контролем (линия Пирятин), то же самое наблюдается и с самцами, хотя в случае самцов снижение незначительно. Скрещивание ciDC-S x W-10 показало, что по сравнению с контролем (линия W-10) уровень АГ самцов снизился до уровня нормы. Этот показатель у самок тоже снизился, но незначительно и в целом остался на высоком уровне. При сравнении со вторым (линия ciDC-S) потомство от скрещивания ciD C-S x Пирятин характеризуется снижением уровня АГ как у самцов, так и у самок. В скрещивании ciDC-S x W-10 наблюдается незначительное уменьшение уровня АГ у самок, и резкое снижение (до уровня нормы) показателя у самцов.

Экспрессивность признака ciD

Анализ экспрессивности признака ciD проводили у потомков двух гибридных скрещиваний (Рис. 5.), контролем для которых служила линия ciDC-S. Установлено, что в случае скрещивания ciDC-S x W-10 по сравнению с контролем у самок наблюдается незначительное уменьшение экспрессивности исследуемого признака, как на правом, так и на левом крыле. У самцов выявлены аналогичные изменения. При этом самцы - потомки скрещивания ciDC-S x W-10 характеризуются большей экспрессивностью признака ciD, нежели самки. Такой же результат был показан и для контроля - линии ciDC-S, в которой большая экспрессивность ciD была характерна для самцов.

В скрещивании ciDC-S x Пирятин, по сравнению с контролем, экспрессивность ciD возросла у самцов и у самок на левом и правом крыле сравнительно одинаково. При этом у самок и самцов этот показатель находится примерно на одном уровне на обоих крыльях.

Во всех экспериментальных вариантах не выявлено асимметрии в проявлении признака на левом и правом крыле у особей обоих полов.